Summary
Indüklenebilir lizin dekarboksilaz aktivitesi toluen diferansiyel çözünürlüğü adducts oluşturmak için substrat L-lizin ve ürün cadaverine 2,4,6-trinitrobenzensulfonic asit ile reaksiyona girerek izlenir.
Abstract
1 ve inanılmaz derecede düşük pH düşebilir memeli mide geçişi de dahil olmak üzere aşırı asit vurguluyor hayatta kalmak için - Escherichia coli, pH değerleri (9 pH 5) geniş bir yelpazede üzerinde büyüyen yetenekli bir enterik bakteridir pH 1 - 2 2. Asidik pH hayatta kalma, E. gibi geniş bir yelpazede etkinleştirmek için coli, bir proton-bağımlı bir şekilde decarboxylate kendi substrat amino asitler dolayısıyla iç pH yükselterek dört farklı indüklenebilir amino asit dekarboksilaz sahiptir . Dekarboksilaz glutamik asit dekarboksilaz GADA ve GadB 3, arginin dekarboksilaz adia 4, lisin dekarboksilaz LdcI 5, 6 ve ornitin dekarboksilaz SpeF 7 içerir. Tüm bu enzimlerin piridoksal-5'-fosfat, co-faktör 8 olarak kullanmaktadır ve dış ortama taze substrat karşılığında 2 dekarboksilasyon ürünleri kaldırın iç membran substrat ürün antiporters birlikte işlev görür. LdcI durumunda, lizin-cadaverine antiporter CadB denir. Son zamanlarda, 2.0 Å LdcI X-ray kristal yapısı belirlenir ve LdcI sıkı yanıt regülatör guanozin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp) 14 bağlı bir roman küçük molekül keşfetti. Katlanarak büyüyen hücrelerin besin yoksunluğu ya da diğer stresler 9 bir dizi deneyim sıkı bir tepki oluşur. Sonuç olarak, hücreler, üstel büyüme, sabit faz büyüme 10 vardiya sonuçlanan bir sinyal kaskad yol açar ppGpp üretirler . Biz ppGpp LdcI 14 spesifik bir inhibitörü olduğunu göstermiştir. Burada Phan ve arkadaşları tarafından geliştirilen testin modifiye lisin dekarboksilaz deneyi açıklar. 11, LdcI faaliyeti ve bu faaliyetin pppGpp / ppGpp etkisini belirlemek için kullanmış olduğunuz. LdcI dekarboksilasyon tepki L-lizin α-karboksi grubu kaldırır ve karbon dioksit ve poliamin cadaverine (1,5-diaminopentane) 5 üretir. L-lizin ve cadaverine sırasıyla, N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (EGM-cadaverine) ve N, N'-bistrinitrophenyllysine (EGM-lisin) oluşturmak için yüksek pH 2,4,6-trinitrobenzensulfonic asit (TNBS) ile reaksiyona girer. 11. EGM-cadaverine, ikincisi ise (Bakınız Şekil 1) eski, toluen gibi organik çözücülerde çözünür olarak EGM-lizin ayrılabilir. Testin doğrusal aralığı, ampirik olarak saflaştırılmış cadaverine kullanarak tespit edildi.
Protocol
1) Reaktifler ve Ekipmanları
- İlk olarak, aşağıdaki üç çözümleri hazırlamak: Çözüm 1 ml 8 mM L-lizin, 100 mM sodyum 2 yapıldığı A - (N-morfolino) ethanesulphonic asit (MES), pH 6.5, nükleotid nükleotid 0.2 mM, ya: guanozin difosfat (GSYİH), guanozin trifosfat (GTP), guanozin 5'-difosfat, 3'-difosfat (ppGpp), ya da guanozin 5'-trifosfat, 3'-difosfat (pppGpp), 0.1 mM piridoksal 5'-fosfat (PLP) ve 1 mM β-mercaptoethanol / (β-ME). 100 mM sodyum (MES), pH 6.5, 0.1 mM PLP, 1 mM β-ME ve 50 nM LdcI oluşur Çözüm B 1 ml. Snider ve ark açıklandığı gibi LdcI saflaştırılmış 6 ve Kanjee ve ark. 14.
Çözüm B aynıdır ama LdcI içermez Çözüm C 1 ml. - 100 ml, 96-iyi polistiren plaka çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun içine 1 M sodyum karbonat (10,6 g/100 mL) ve 50 mcL kısım oluşan stop bir çözüm hazırlayın. Plaka 30 mcL su ekleyin ve sonra da kapsayacak. Su hacmi toplamına eklenir ve enzim reaksiyon sırasında çıkarılan örnek hacmi 50 mcL eşit olduğunu unutmayın. Bu durumda, 20 enzim reaksiyon örnek mcL silinecektir.
- 294 mcL% 5 (w / v) TNBS stok, alüminyum folyo 4706 mcL su, şal ile seyreltilmesi ile 5 ml 10 mM TNBS çözüm hazırlayın ve buz üzerinde tutmak.
- Eppendorf ThermoStat dengeye Plus 37 ° C ThermoStat Plus, 6 sütun 24 kuyu vardır. Şematik için Bkz: Şekil 2. (Başına bir sütun) test edilecek nükleotid kimliğini belirten Etiket 1.5 ml Eppendorf tüpleri: GTP (sütun A), GSYH (sütun B), ppGpp (C sütunu), pppGpp (D sütunu), herhangi bir nükleotid (E sütununda ), ve protein örnekleri (sütun F).
- Raf her bir alternatif satır toplam dört satır ipuçları veren ihmal olduğu gibi 200 mcL ipuçları birkaç kutuları. Bu enzim tahlil sırasında ThermoStat Plus heatblock ile çok kanallı pipet kullanımı için gereklidir.
- 42 Dijital Heatblock (VWR) dengelenmesi ° C.
- Soğutmak için buz üzerinde 96-de 2.0 ml polipropilen levha yerleştirin.
2) LdcI Testi
- Çözüm kısım 50 mcL Eppendorf ThermoStat beş sütunların her biri 1.5 mL Eppendorf tüpleri için uygun nükleotid.
- F sütunundaki üç tüp Çözüm B 330 mcL ekleyin ve sütun F. nihai tüp Çözüm C (protein kontrol) 330 mcL ekleyin
- 37 çözümler dengeye ° C beş dakika boyunca. İpucu: 5 dakika sonra, sonraki kullanılmak üzere çok kanallı pipet ile müdahale bunları önlemek için, merkezi ısıtma-blok tüplerin kapakları kesilmiş.
- F sütunundaki tüpleri, sütunların AE tüpleri her birine bir 5-50 mcL VWR çok kanallı pipet, transfer 50 mcL kullanma. En kısa sürede ilk tüp karışık olarak Sayacı başlat.
- 2, 4 ve 6 dakika 20 mcL çok kanallı pipet kullanarak örnek çıkarın ve stop çözüm ekleyin.
- Not: durak çözüm örnekleri, plastik ambalaj malzemesi ile kaplanmış ve daha sonraki işlem için -20 ° C'de dondurulmuş olabilir. Plakalar TNBS ile reaksiyona önce oda sıcaklığında çözdürülmelidir.
3) TNBS Reaksiyon ve Renk Geliştirme
- 6 dakika sonra çok kanallı pipet ve 42 inkübe ° C kullanarak stop çözüm için 10 mM TNBS çözümü 50 mcL ekleyin. TNBS lizin ve cadaverine ile reaksiyona girerek çözüm, koyu sarı / turuncu renk dönecek.
- 6 dakika sonra, tepki yavaşlaması, buz üzerinde plaka soğutun.
- Örnek bir VWR 20-200 mcL çok kanallı pipet ve yer buz üzerinde soğutulur 2 mL derin kuyu plaka kullanarak 100 mcL çıkarın. Fumehood buz kovası aktarın.
- HandyStep (Marka) tekrar pipet ve 12.5 ml pipet (Plastibrand) kullanarak her toluen 500 mcL ekleyin.
- Bir kimwipe kullanarak herhangi bir aşırı toluen siliniz ve ambalaj bant şeritler ile plaka kapsayacak. Iyi bir sızdırmazlık elde etmek için sıkıca bastırın emin olun. 96-plaka düz bir kapak ile örtün ve sonra 1 dakika ve 30 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır.
- Çözümleri 5 dakika dinlendiriniz bırakın. EGM-cadaverine EGM-lizin su (bkz. Şekil 1) çözünür kalırken, üst toluen faz şimdi.
- Toluen okumak için 96-iyi bir plaka haline 20-200 mcL çok kanallı pipet kullanarak 200 mcL çıkarın. Not: Her numune kaldırılıyor açıktır ve herhangi bir alt sulu faz bulunmamış kontrol etmek için emin olun. Not: çok kanallı pipet toluen tarafından zarar görmesini önlemek için kullanılan bariyer ipuçları.
- SPECTRAmax 340 plaka okuyucu 340 nm'de absorbans okuyun.
- Kuvars plağı temizlemek için, toluen su ile yıkayın ve büyük bir kuvars plakadavlumbaz cam tepsi. 100 mL% 70 (v / v) nitrik asit 07:03 karışımı üzerine dökün:% 95 (v / v) etanol ve ikinci bir cam tepsi ile kuvars tabak kapağı. Uyarı: reaksiyon çok ekzotermik ve bazen patlayıcı aşınma uygun koruma ve davlumbaz kanat alt 6 "düzeyi ayarlanmış olduğundan emin olunuz Soğuduktan sonra nitrik asit, su ile yıkayın ve ardından% 95 etanol.
4) Temsilcisi Sonuçlar
1) Cadaverine Standart Eğrisi (Şekil 3)
Herhangi bir L-lizin veya LdcI olmadan açıklanan, ancak tahlil yapıldı ve cadaverine yerine çeşitli konsantrasyonlarda ampirik testinin doğrusal aralığı belirlemek için kullanılır. Testin ~ 22 nmoles cadaverine (Şekil 3) karşılık gelen 0.25 OD 340 doğrusal oldu.
LdcI, 2) Etkinlik (Şekil 4)
Yalnız LdcI faaliyet 153.5 (± 18.1) nmoles cadaverine min-1 pH değeri 6.5 mg LdcI-1 olarak tespit edilmiştir LdcI faaliyet 100 mcM GTP veya GDP varlığı etkilenmez ama güçlü pppGpp ve ppGpp (Şekil 4) varlığı (> 10 kat) inhibe edilir.
Şekil 1. LdcI reaksiyon şematik diyagramı, CO 2 ve cadaverine oluşturmak için L-lizin dekarboksilasyon reaksiyon, N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (EGM-cadaverine) ve N, N oluşturmak için de yüksek pH TNBS ile sonraki tepki olarak gösterilir '-bistrinitrophenyllysine (EGM-lisin). Phan et al.11
Şekil 2. Eppendorf Termostat Kurulumu iyi 24-Eppendorf ThermoStat örnekleri düzen testinin adımları açıklamasına (kalın olarak gösterilir) ile birlikte gösterilmiştir. Oklar reaksiyon çözümleri protokole göre transfer gösterir. 96-plaka durak çözüm tepki çözüm kaldırılması da belirtilir.
Şekil 3. Cadaverine Standart Eğrisi. Cadaverine, nmoles karşı 340 nm'de absorbans bir arsa verilmiştir. Hata çubukları, en az üç bağımsız ölçümleri standart sapmasını temsil eder. En uygun hat da gösterilir ve 0,996 bir R2 sahiptir.
Şekil 4. LdcI tahlil sonuçları LdcI aktivite oranı arsa 100 mcM GTP, GSYİH, pppGpp, ppGpp varlığı ve yokluğu nükleotid gösterilmiştir (nmoles cadaverine min-1 mg-1 LdcI üretilen). Sıkı yanıt nükleotidler (p) ppGpp LdcI aktivite önemli ölçüde inhibe yeteneğine sahiptir. Hata çubukları, en az altı bağımsız ölçümleri standart sapmasını temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lisin dekarboksilaz tayininde, TNBS EGM-lizin ve EGM-cadaverine adducts (Şekil 1) oluşturmak için L-lizin ve cadaverine birincil aminler ile reaksiyona girer. Karboksilik asit grubu eksik EGM-cadaverine, toluen 11 bölünme yeteneğine sahip iken, EGM-lizin karboksilik asit grubun varlığı nedeniyle, bu adduct suda çözünür kalır. Bu tip testin bir karboksilik asit grubu kaybı reaksiyon sırasında ortaya çıkan amino asitler diğer türleri hakkında daha geniş kullanılabilir. Bu indüklenebilir ornitin dekarboksilaz SpeF indüklenebilir arginin dekarboksilaz adia poliamin putrescine 7 ve L-arginine dekarboksilasyon poliamin agmatin 4 formunu oluşturmak için L-ornitin dekarboksilasyon sırasında oluşur.
Burada açıklanan LdcI tahlil, saflaştırılmış protein in vitro aktivitesinin belirlenmesi için nispeten hızlı bir yöntem sağlar. Bu testin en önemli avantajları şunlardır:
deney başına her ölçüm hassasiyeti artırır i) birden fazla kullanımı çoğaltır;
ii) testi protokol değişiklik yapmadan geniş bir tampon koşulları (farklı pH, tuz, vb azaltarak) üzerinden yapılabilir;
iii) testi, hücre büyümesi sırasında atılan cadaverine miktarını belirleyerek LdcI in vivo aktivitesini ölçmek için değiştirilebilir .
Bu testin en önemli sınırlamalar şunlardır:
i deneyler) duyarlılığı EGM-adducts absorbans doğrusal aralığı ile sınırlıdır;
ii) birden fazla işlem adımları deneysel hataların büyüklüğünü artırmak;
iii) tüm amino asit dekarboksilaz protokol bu tür için uygun. Örneğin, indüklenebilir glutamik asit dekarboksilaz L-glutamik asit dekarboksilasyon GADA / GadB γ-amino bütirik asit 2, yan zincirinin karboksilik asidin varlığı nedeniyle suda çözünür olacağı TNBS adduct üretir grubu.
E. asit stres yanıtı biyokimyasal soruşturma coli, bir araştırma genişleyen alanıdır ve bizi daha iyi E. stres yanıtı moleküler temelini anlamak için izin verecek coli ve ilgili Salmonella enterica serovar Typhimurium 12 ve 13 Vibrio kolera gibi benzer asit stres yanıt sistemleri olduğunu γ-proteobakteride. LdcI faaliyet sıkı yanıt regülatör ppGpp tarafından inhibe olduğunu keşfi, bu proteinin yönetmelik içine önceden bilinmeyen bir bakış açısı ile bize sağladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz bize bakteri suşlarının plazmid ve gerekli protokolleri göndermek için Dr. Michael Cashel (Sağlık, Bethesda, MA, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri) teşekkür ederim. Biz SpecraMax plaka okuyucu kullanımı için Dr. John Glover (Biyokimya Anabilim Dalı, Toronto Üniversitesi) teşekkür ederim. İngiltere, Kanada Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Lisansüstü Bursu, Hastalıklara Bağlı Membran Proteinlerin Yapısal Biyoloji, Kanada Sağlık Araştırma Stratejik Eğitim Programı Enstitüleri ve Toronto Açık Bursu Üniversitesi alıcı. Bu çalışma WAH Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (MOP-67.210) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
