पैच एक डार्क अनुकूलित स्लाइस तैयारी में माउस रेटिना न्यूरॉन्स से दबाना रिकॉर्डिंग

Summary

यहाँ हम electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए माउस रेटिना के अंधेरे अनुकूलित स्लाइस पैदा करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन.

Abstract

हमारे दृश्य अनुभव शुरू की है जब हमारी रेटिना photoreceptors में दृश्य रंगद्रव्य ऊर्जा के प्रकाश photons अवशोषित और intracellular घटनाओं है कि कोशिका झिल्ली में चक्रीय nucleotide-gated चैनलों को बंद करने के लिए नेतृत्व का एक झरना शुरू. झिल्ली क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन दोनों रॉड और कोन synaptic टर्मिनलों से neurotransmitter रिहाई की राशि में कटौती करने के लिए बारी में होता है. मापने के लिए प्रकाश पैदा परिवर्तन फोटोरिसेप्टर झिल्ली क्षमता में रेटिना में बहाव गतिविधि की ओर जाता है है, वैज्ञानिकों ^{दशकों} 1,2 के लिए रेटिना टुकड़ा तैयारी से electrophysiological रिकॉर्डिंग बना दिया है. अतीत में इन स्लाइस रेटिना ऊतक कि फिल्टर पेपर से जुड़ा हुआ है पर एक धार के साथ किया गया है मैन्युअल काट, टुकड़ा करने की क्रिया के एक अन्य विधि हाल के वर्षों में विकसित किया गया है जिससे रेटिना ऊतक कम gelling तापमान अगर में एम्बेडेड है और एक साथ शांत समाधान में कटा हुआ ^3,4 सूक्ष्म तक्षणी हिल. यह तैयारी कम नुकसान और सतह बहुत मजबूत प्रकाश पैदा प्रतिक्रियाओं के साथ रेटिना स्लाइस पैदा करता है. यहाँ हम दस्तावेज़ कैसे इस प्रक्रिया अवरक्त दृश्य रंगद्रव्य विरंजन से बचने के प्रकाश के तहत किया जा सकता है.

Protocol

1. तैयारी इलेक्ट्रोड

1. उन्हें दोनों 1M NaCl में सूई और उन दोनों के बीच ड्राइविंग 15V ~ 20 एस के लिए एक 1 हर्ट्ज साइन लहर का उपयोग करके रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड की तैयारी
2. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उपयोग कर एक micropipette डांड़ी (Sutter उपकरण P-97). के लिए पैच pipettes 1.2 मिमी की एक बाहरी व्यास और 0.69 मिमी (Sutter उपकरण, बिल्ली # B120-69-10) की एक आंतरिक व्यास के साथ एक borosilicate ग्लास का उपयोग करें. इलेक्ट्रोड की नोक के माध्यम से श्रृंखला प्रतिरोध उपाय. लक्ष्य कोशिकाओं के आकार के आधार पर एक विंदुक टिप व्यास का चयन करें, सेल शरीर के लिए ~ ~ सेल शरीर के लिए MΩ 5 ~ व्यास उपयोग में 5 सुक्ष्ममापी ~ व्यास उपयोग में 20 सुक्ष्ममापी MΩ 12.
3. जमीन / संदर्भ इलेक्ट्रोड तैयार. 1M NaCl में, एक सिरिंज का उपयोग 1 मिमी NaCl के साथ एक छोटा सा वर्ग polyethylene (Intramedic, PE205) टयूबिंग है कि 3.5% अग्रवाल भी शामिल है (बिल्ली A7002 # सिग्मा) को भरने. इस संदर्भ / एजी AgCl इलेक्ट्रोड पर अगर पुल रखें.

2. तैयारी समाधान

1. बाहरी स्नान समाधान, एम्स '(1 एल) बिकारबोनिट युक्त मीडिया: एम्स की 1 बोतल' मध्यम (सिग्मा; A1420 # बिल्ली), ₃ NaHCO के 1.9 ग्राम, पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन के 7 एमएल (सिग्मा, बिल्ली P0781 #) जीवाणु को रोकने के विकास. ~~ 280 mOsm osmolarity समायोजित करें.
2. समाधान टुकड़ा करने की क्रिया, एम्स पीएच बफर HEPES (1 एल) युक्त मीडिया: 1 बोतल एम्स के 'मध्यम, NaCl के 0.887 ग्राम, HEPES की 2.38 ग्राम, पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन के 7 एमएल. पीएच 7.4 ~ समायोजित 1M NaOH और / या 1M एचसीएल का उपयोग. ~~ 280 mOsm osmolarity समायोजित करें.
3. पोटेशियम-aspartate (कश्मीर एएसपी) विंदुक आंतरिक (मिमी में) समाधान: 125 कश्मीर aspartate, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0.5 ₂ CaCl, 1 एटीपी मिलीग्राम, 0.2 GTP-मिलीग्राम; पीएच को समायोजित है ~ NMG 7.3 के साथ ओह, और osmolarity ~~ 280 mOsm निकाला जाता है.
4. स्थिर बीच बढ़िया तालमेल कम तापमान रेटिना युक्त agarose (वजन द्वारा 5%), 7.5 जी के अग्रवाल (सिग्मा, बिल्ली A7002 #) के लिए अग्रवाल backstop DH ₂ ओ के 150 एमएल में पिघल

3. प्रयोग का दिन

1. ~ पिघलना कश्मीर Asp आंतरिक समाधान और फ्रीजर से अपनी पसंद के fluorophore 1.5 एमएल. उपयुक्त एकाग्रता है, जो empirically निर्धारित किया जाना चाहिए fluorophore पतला.
2. 'एम्स प्रकाश तंग भंडारण और फिर पानी के स्नान (30-32 डिग्री सेल्सियस) में कंटेनर जगह में ₃ NaHCO (~ 200 एमएल) युक्त मीडिया डालो और ₂ / 95% 5% सीओ के साथ _हे 2 गैस संतुलित
3. ~ 'एम्स बर्फ पर HEPES, जगह युक्त मीडिया के 110 एमएल के साथ बोतल भरें और _{100% 2} हे के साथ संतुलित .
4. शेष 'एम्स फैराडे पिंजरे के शीर्ष पर एक गर्म जलाशय में NaHCO ₃ युक्त मीडिया प्लेस, और 5% सीओ ₂ / हे 95% ₂ गैस के साथ संतुलित. Parafilm समाधान ऊपर अंतरिक्ष में गैस जाल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. 'एम्स के मीडिया की 25 एमएल HEPES और गर्मी ~ डिग्री सेल्सियस agarose पिघल 115 पर समाधान के साथ; (कैट A0701 # सिग्मा) 0.75 ग्राम जोड़कर कम gelling तापमान agarose (3%) तैयार करें. बुलबुले के बिना स्पष्ट है, और एक पानी के स्नान में दुकान समाधान तक हिलाओ (~ 42 डिग्री सेल्सियस).
6. कश्मीर Asp आंतरिक समाधान के साथ एक रिकॉर्डिंग विंदुक भरें और टिप प्रतिरोध की जाँच करें.

4. प्रयोग शुरू

1. माउस euthanize और जल्दी घुमावदार कैंची का उपयोग आँखों को हटाने. इन्फ्रारेड चश्मे सभी प्रक्रियाओं दृश्य वर्णक के विरंजन रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
2. उन्हें रोलिंग, और एक पतली डबल पक्षीय ब्लेड का उपयोग करने से रोकने के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर आँखें प्लेस, कॉर्निया में एक भट्ठा जबकि संदंश के साथ आंख पकड़.
3. जैसे ही नेत्रगोलक पंचर है, वे एक 'एम्स मीडिया के साथ भरा पकवान में आंख हस्तांतरण.
4. एक प्रवेश बिंदु के रूप में कॉर्निया में भट्ठा का प्रयोग, छोटे कैंची को दूर कॉर्निया के शेष भागों में कटौती, जो बाद लेंस और शीशे का हटाया जा सकता है उपयोग किया जाता है. सावधान रहें कि रेटिना eyecup करने के लिए संलग्न रहता है, और अंधेरे में 32 पर eyecup ° C 'एम्स 5% सीओ ₂ / 95% ₂ हे के साथ equilibrated मीडिया में दुकान .

5. टुकड़ा करने की क्रिया

1. एक eyecups Hemisect और रेटिना रेटिना वर्णक उपकला से अलग कर देना. रेटिना के किनारों निकालें ऊतक फ्लैट झूठ करने की अनुमति है.
2. एक लाटेकस बल्ब के साथ एक छोटा गिलास पाश्चर विंदुक प्रयोग के लिए एक 35 मिमी के साथ पेट्री डिश पिघल अगर भरने, और अगर माध्यम से भर संदंश खींचें इसकी स्थिरता का परीक्षण.
3. जब आप देखते हैं अगर जमना शुरू कर सकते हैं हैं:
   1. अगर के शीर्ष करने के लिए रेटिना स्थानांतरण.
   2. Kimwipe का एक मुड़ टुकड़ा का उपयोग करने के लिए रेटिना के आसपास अतिरिक्त समाधान को अवशोषित.
   3. 2-3 जगह अग्रवाल के सीधे रेटिना पर बूँदें और जल्दी से रेटिना पर एक प्लास्टिक सिलेंडर की जगह के लिए इसके चारों ओर एक दीवार के रूप में. फिर प्लास्टिक सिलेंडर के पक्ष नीचे अतिरिक्त पिघल अगर ड्रिप जबकि अगर भीतर रेटिना केंद्रित.
   4. पेट्री डिश टी स्थानांतरणएक बर्फ के पानी के स्नान के लिए शांत ओ.
4. ~ 45 सेकंड के बाद से बर्फ के पानी स्नान ऊतक को हटाने और एक गोताख़ोर का उपयोग करने के लिए बाहर निकालना अगर प्लास्टिक सिलेंडर के बाहर ब्लॉक, रेटिना से दूर की ओर से धक्का.
5. अगर युक्त रेटिना के बाहर एक छोटी सी ब्लॉक में कटौती और नमूना डिस्क पर अगर backstop के खिलाफ जगह में ब्लॉक superglue एक तरफा रेजर ब्लेड का प्रयोग करें.
6. सूक्ष्म तक्षणी ट्रे हिल के लिए नमूना डिस्क स्थानांतरण और रेटिना के साथ ब्लॉक पूरी तरह से पानी में डुबोया हुआ अनुमति ट्रे में बर्फ ठंड एम्स HEPES डालना.
7. ~ 200 सुक्ष्ममापी की एक मोटाई के साथ रेटिना स्लाइस अधिकतम ब्लेड हिल दर पर काटा जा सकता है और एक आगे की ब्लेड गति सेट ऐसी है कि यह 4 से 5 सेकंड लेता है प्रत्येक टुकड़ा पर रेटिना के माध्यम से कटौती.
8. नंबर 11 स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करने के लिए एक समय में प्रत्येक प्रयोग करने योग्य टुकड़ा एक हटायें
9. अच्छा रेटिना युक्त स्लाइस रिकॉर्डिंग कोठरियों में रखा जाता है और नायलॉन उन्हें पार धागे के साथ टुकड़ा एंकर के साथ नीचे भारित. नायलॉन के धागे नीचे रेटिना आसपास अगर पकड़, रिकॉर्डिंग के लिए unobstructed रेटिना जा.
10. ईमानदार माइक्रोस्कोप के चरण के लिए स्थानांतरण रिकॉर्डिंग कक्ष, पर्दे बंद और अवरक्त प्रकाश स्रोत पर बारी के लिए एक अवरक्त संवेदनशील कैमरा पर टुकड़ा देखने के.

6. रिकॉर्डिंग

1. एक बार एक अच्छा रेटिना टुकड़ा (बरकरार photoreceptors और उचित काटने कोण के साथ) की पहचान की है एक दर पर रेटिना perfusing शुरू से अधिक मीडिया गरम 'एम्स कि 37 35 गरम किया जाता है के साथ एमएल / मिनट 5 डिग्री _{सेल्सियस} और 5% सीओ 2 के साथ equilibrated / 95% ₂ हे.
2. कुछ सतह को नुकसान स्पष्ट टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के कारण हो सकता है. कोशिकाओं का यह आमतौर पर पतली परत एक टूटी हुई टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग हटाया जा सकता है, और धीरे दूर मृत सेल शरीर चूसने. यह आम तौर पर जीवित कोशिकाओं के नीचे प्रकट होगा. एक स्वस्थ कोशिका जिसका शरीर की स्थिति हित के स्तर में स्थित है पहचानें.
3. KAsp आंतरिक समाधान के साथ एक micropipette भरें और विंदुक की नोक के माध्यम से सकारात्मक दबाव (जावक) लागू होते हैं, और रिकॉर्डिंग कक्ष में पिपेट की नोक कम है और एक सेल का उपयोग micromanipulator के स्तर के नीचे.
4. ऐसी है कि यह कोशिका झिल्ली डिम्पल विंदुक टिप ले जाएँ, और कोमल नकारात्मक (आवक) के लिए एक उच्च प्रतिरोध सील कर दबाव लागू होते हैं. पूरे सेल मोड इलेक्ट्रोड के लिए नकारात्मक दबाव लागू करने के लिए सेल में तोड़ने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
5. रेटिना एल ई डी का उपयोग ऊतक उत्तेजक तब प्रकाश में प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकते हैं.
6. सेल तस्वीर जिसमें से रिकॉर्डिंग विंदुक आंतरिक समाधान में fluorophore से प्रतिदीप्ति evoking द्वारा बनाया गया था.

7. प्रतिनिधि परिणाम

1 यहाँ चित्रा, एक अंधेरे अनुकूलित बढ़ती ताकत के प्रकाश की चमक के लिए दिखाए जाते हैं रेटिना न्यूरॉन की क्षमता प्रकाश पैदा .

चित्रा 2 से प्रतिदीप्ति चित्र एक रेटिना टुकड़ा है जहां कोशिकाओं fluorophore, लूसिफ़ेर पीला के साथ भर दिया गया है. पैदा प्रतिदीप्ति जो पैच रिकॉर्डिंग से किए गए थे कोशिकाओं की आकारिकी से पता चलता है.

Discussion

हड्डीवाला retinas से स्लाइस रिकॉर्डिंग ^1,2 दशकों के लिए किया गया है, और कैसे रेटिना circuitry घटना प्रकाश encodes की एक गहरी समझ प्रदान करने में काफी सफल रहा. एक हिल सूक्ष्म तक्षणी के साथ कटौती की तुलना में सीधे बल्कि एक धार के साथ लाभ यह है कि रेटिना स्लाइस की सतह पर कम नुकसान उठाना. एक चूषण विंदुक के साथ यह आसान है और सतह है कि रेटिना सर्किट, जहां सेल प्रकार ^के सबसे 5,6 पहचान की गई है में उनके कनेक्टिविटी बनाए रखने के ठीक नीचे इस नुकसान लक्ष्य स्वस्थ कोशिकाओं को हटाने के, और कि प्रदर्शन मजबूत प्रतिक्रियाओं प्रकाश में. इस प्रकार पैच अंधेरे अनुकूलित रेटिना स्लाइस से दबाना रिकॉर्डिंग पहचान तंत्रिका संगणना में सेल वर्गों द्वारा निभाई गई भूमिकाओं का निर्धारण करने के लिए एक अन्वेषक की अनुमति कर सकते हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781