Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Abstract

Unser visuelles Erlebnis wird eingeleitet, wenn die visuelle Pigment in unserer Netzhaut Photonen des Lichts absorbiert und löst eine Kaskade von intrazellulären Ereignissen, die Schließung von zyklisch-Nukleotid-gesteuerte Kanäle in der Zellmembran führt. Die daraus resultierende Veränderung des Membranpotentials führt wiederum zu Kürzungen in Höhe von Neurotransmittern aus beiden Stäbchen und Zapfen synaptischen Terminals. Um zu messen, wie das Licht hervorgerufene Veränderung der Photorezeptor Membranpotentials führt zu nachgelagerten Aktivitäten in der Netzhaut, haben Wissenschaftler elektrophysiologischen Ableitungen von Netzhaut-Scheibe Vorbereitungen für Jahrzehnte ^1,2 gemacht. In der Vergangenheit waren diese Scheiben wurden von Hand mit einer Rasierklinge auf die retinale Gewebe, das auf Filterpapier befestigt wird geschnitten, in den letzten Jahren eine andere Methode des Schneidens wurde entwickelt, wobei Netzhautgewebe in niedrigen Geliertemperatur Agar eingebettet ist und in Scheiben geschnitten in coole Lösung mit einem vibrierenden Mikrotom ^3,4. Dieses Präparat produziert Netzhaut Scheiben mit weniger Beschädigung der Oberfläche und sehr robust Licht hervorgerufenen Reaktionen. Hier dokumentieren wir, wie dieses Verfahren unter Infrarot-Licht zu vermeiden, Bleichen der Sehpigment getan werden kann.

Protocol

1. Herstellung von Elektroden

1. Bereiten Sie die Aufnahme-und Referenz-Elektroden durch Eintauchen sowohl in 1M NaCl und Fahren 15V zwischen ihnen mit einer 1 Hz Sinuswelle für ~ 20 s.
2. Machen Sie die Aufnahme Elektroden mit einer Mikropipette Puller (Sutter Instruments P-97). Für Patch-Pipetten mit einem Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,2 mm und einem Innendurchmesser von 0,69 mm (Sutter Instruments, Kat. Nr. B120-69 bis 10). Messen Sie den Serienwiderstand durch die Spitze der Elektrode. Basierend auf der Größe der Zielzellen wählen Sie eine Pipettenspitze Durchmesser für die Zellkörper ~ 20 um im Durchmesser verwenden ~ 5 MW für Zellkörper ~ 5 um im Durchmesser verwenden ~ 12 MOhm.
3. Bereiten Boden / Referenzelektroden. Mit einer Spritze füllen einen kleinen Ausschnitt aus Polyethylen-Schlauch (Intramedic, PE205) mit 1 mM NaCl, dass 3,5% Agar enthält (Sigma; Cat # A7002) in 1M NaCl. Legen Sie dieses Agar Brücke über die Ag / AgCl-Referenzelektrode.

2. Herstellung von Lösungen

1. Externe Badlösung, Ames 'Medien mit Bicarbonat (1 L): 1 Flasche Ames' Medium (Sigma; Cat # A1420), 1,9 g NaHCO _3, 7 ml Penicillin-Streptomycin (Sigma, Kat. Nr. P0781) zu verhindern, bakterielle Wachstum. Passen Osmolarität auf ~ 280 mOsm.
2. Slicing-Lösung, Ames 'Medien mit dem pH-Puffer HEPES (1 L): 1 Flasche Ames' Medium, 0,887 g NaCl, 2,38 g HEPES, 7 ml Penicillin-Streptomycin. Der pH-Wert auf ~ 7,4 mit 1 M NaOH und / oder 1 M HCl. Passen Osmolarität auf ~ 280 mOsm.
3. Kalium-Aspartat (K-Asp) Pipette interne Lösung (in mM): 125 K-Aspartat, 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0,5 CaCl _2, 1 ATP-Mg, 0,2 GTP-Mg, pH-Wert wird eingestellt ~ 7,3 mit NMG-OH, und Osmolarität auf ~ 280 mOsm eingestellt.
4. Agar Rücklaufsperre für die Stabilisierung niedriger Geliertemperatur Agarose mit der Netzhaut (5 Gew.%), 7,5 g Agar (Sigma; Cat # A7002) in 150 ml dH ₂ O. geschmolzen

3. Day of Experiment

1. Thaw ~ 1,5 ml K-Asp Internal Solution und dem Fluorophor Ihrer Wahl aus dem Gefrierschrank. Verdünnen Sie die Fluorophor auf die geeignete Konzentration, die empirisch ermittelt werden sollte.
2. Gießen Ames 'Medien mit NaHCO ₃ (~ 200 ml) in die lichtdichte Vorratsbehälter und legen Sie dann in das Wasserbad (30-32 ° C) und im Gleichgewicht mit 5% CO ₂ / 95% O _2-Gas
3. Fill-Flasche mit ~ 110 ml Ames 'Medien mit HEPES, auf Eis stellen und im Gleichgewicht mit 100% O _2.
4. Die restlichen Ames 'Medien mit NaHCO ₃ in einem beheizten Reservoir auf der Oberseite des Faraday-Käfig, und im Gleichgewicht mit 5% CO ₂ / 95% O _2-Gas. Parafilm verwendet werden, um das Gas in den Raum oberhalb der Lösung Falle sein.
5. Bereiten Sie die niedrigen Geliertemperatur Agarose (3%) durch Zugabe von 0,75 g (Sigma; Cat # A0701) zu 25 ml Ames 'Medien mit HEPES und Wärme der Lösung bei ca. 115 ° C um die Agarose zu schmelzen. Rühren, bis die Lösung klar, ohne Blasen, und speichern Sie in einem Wasserbad (ca. 42 ° C).
6. Füllen Sie eine Aufzeichnung Pipette mit dem K-Asp interne Lösung und überprüfen Sie die Spitze Widerstand.

4. Begin Experiment

1. Euthanize der Maus und schnell zu entfernen, die Augen mit einer gebogenen Schere. Infrarot-Schutzbrillen sollten für alle Verfahren, um zu verhindern das Ausbleichen der visuellen Pigment verwendet werden.
2. Legen Sie die Augen auf ein Stück Filterpapier, um sie von Rollen, und mit einem dünnen doppelseitigen Klinge zu vermeiden, stellen einen Schlitz in die Hornhaut, während das Auge mit der Pinzette.
3. Sobald der Augapfel ist punktiert, übertragen sie Auge in eine Schale mit Ames 'Medien gefüllt.
4. Mit den Schlitz in die Hornhaut als Einstieg, sind kleine Schere zum Schneiden entfernt die restlichen Teile der Hornhaut, nach dem die Linse und Glaskörper entfernt werden können. Achten Sie darauf, dass die Netzhaut an der Augenmuschel bleibt, und speichern Sie die Augenmuschel in Dunkelheit bei 32 ° C in Ames 'media äquilibriert mit 5% CO ₂ / 95% O _2.

5. Slicing

1. Hemisect einer der Augenmuscheln und distanzieren der Netzhaut von der retinalen Pigmentepithels. Entfernen Sie die Ränder der Netzhaut, damit das Gewebe flach zu liegen.
2. Mit einem kleinen Glas Pasteur Pipette mit einer Latex-Glühlampe auf eine 35 mm Petrischale mit geschmolzenem Agar zu füllen, und ziehen Sie die Zange quer durch den Agar seiner Konsistenz zu testen.
3. Wenn Sie anfangen können, finden Sie in der Agar verfestigt:
   1. Übertragen Sie die Netzhaut an die Spitze des Agar.
   2. Verwenden Sie ein verdrilltes Stück Kimwipe um die überschüssige Lösung rund um die Netzhaut zu absorbieren.
   3. Legen Sie 2-3 Tropfen Agar direkt auf die Netzhaut und schnell statt einer Kunststoff-Zylinder über die Netzhaut an einer Wand um sie herum zu bilden. Dann tropft zusätzliche geschmolzen Agar an den Seiten der Kunststoff-Zylinder, während die Zentrierung der Netzhaut im Agar.
   4. Übertragen Sie die Petrischale to ein Eiswasserbad abkühlen lassen.
4. Nach ~ 45 Sekunden entfernen Sie das Gewebe aus dem Eiswasserbad und mit einem Stößel zu extrudieren die Agar-Block aus der Kunststoff-Zylinder, Schieben von der Seite von der Netzhaut am weitesten.
5. Verwenden Sie die einseitigen Rasierklinge herausgeschnitten ein kleiner Block von Agar mit der Netzhaut und Sekundenkleber den Block in Position gegen die Agar Rücklaufsperre auf der Probe-Disc.
6. Die Probe-Disc auf die vibrierende Mikrotom Tablett und gießen eiskalten Ames HEPES in das Fach ermöglicht den Block mit Netzhaut vollständig eingetaucht werden.
7. Retinal Scheiben mit einer Dicke von ca. 200 mu m kann die maximale Klinge vibriert Zinssenkung und eine vorausschauende Klinge Geschwindigkeit so eingestellt, dass es 4 bis 5 Sekunden dauert, um durch die Netzhaut auf jede Scheibe geschnitten.
8. Verwenden Sie einen Nr. 11 Skalpell zu jedem brauchbaren Scheibe ein zu einer Zeit zu entfernen
9. Gute Scheiben, die Netzhaut sind in der Aufnahme Kammern gelegt und sich mit Scheibe Anker mit Nylonfäden Kreuzung ihnen gewichtet. Die Nylonfäden halten Sie die Agar-Umgebung der Netzhaut, so dass die Netzhaut ungehindert für Aufnahmen.
10. Übertragen Sie die Aufnahme Kammer auf die Bühne des aufrechten Mikroskop, in der Nähe der Vorhang, und schalten Sie den Infrarot-Lichtquelle, um die Scheibe auf eine Infrarot-sensitive Kamera-Ansicht.

6. Aufnahme

1. Sobald eine gute Netzhaut schneiden (mit intakten Photorezeptoren und den entsprechenden Schnittwinkel) identifiziert beginnen Perfusion der Netzhaut mit einer Rate von mehr als 5 ml / min mit beheiztem Ames 'Medien, die 35 37 ° C erhitzt wird und äquilibriert mit 5% CO ₂ / 95% O _2.
2. Einige Beschädigung der Oberfläche kann offensichtlich durch die Slicing-Prozess. In der Regel dünne Schicht von Zellen kann mit Hilfe einer Pipette mit einem gebrochenen Spitze, und sanft Absaugen der Toten Zellkörper. Dies wird in der Regel zeigen lebende Zellen darunter. Identifizieren einer gesunden Zelle Körper, deren Position in den Schichten des Interesses.
3. Füllen einer Mikropipette mit dem Kasp interne Lösung und gelten positive (außen-) Druck durch die Spitze der Pipette, und senken Sie die Spitze der Pipette in die Aufnahme Kammer und bis auf die Ebene der Zelle mit einem Mikromanipulator.
4. Bewegen Sie die Pipette, so dass es die Zellmembran Grübchen, und wenden Sie sanfte negative (nach innen) Druck auf eine hohe Beständigkeit Dichtung zu machen. Whole-cell-Modus kann durch Anlegen von Unterdruck an der Elektrode in die Zelle zu brechen erreicht werden.
5. Förderung der Retina mit LEDs können dann rufen Reaktionen auf Licht.
6. Fotografieren Sie die Zelle, aus der die Aufnahme von evozieren die Fluoreszenz des Fluorophors in der Pipette interne Lösung gemacht wurde.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Hier Potenziale einer dunkeladaptierten Retina Neuron zu Lichtblitze von zunehmender Stärke gezeigt Licht hervorgerufen.

Abbildung 2. Fluoreszenz Bild aus einem der Netzhaut schneiden, wo Zellen mit dem Fluorophor, Lucifer Yellow gefüllt wurden. Evozierte Fluoreszenz zeigt die Morphologie der Zellen, aus denen Patch-Aufnahmen gemacht wurden.

Discussion

Slice-Aufnahme von Wirbeltieren Netzhaut seit Jahrzehnten ^1,2 gemacht und waren recht erfolgreich bei der Bereitstellung ein tieferes Verständnis davon, wie die Netzhaut Schaltung kodiert einfallenden Lichts. Die Vorteile des Schneidens mit einem vibrierenden Mikrotom anstatt direkt mit einer Rasierklinge ist, dass die Netzhaut Scheiben weniger Schaden an der Oberfläche entstehen. Mit einer Saugpipette ist es leicht, diese Schäden und Ziel gesunde Zellen direkt unter der Oberfläche, dass ihre Verbindung in der Netzhaut-Schaltung, wo die meisten Zelltypen ^5,6 identifiziert behalten zu entfernen, und das Display robust Reaktionen auf Licht. So Patch Clamp Messungen von dunkel-adaptierten Retina Scheiben kann damit ein Ermittler, um die Rollen von identifizierten Zelle Klassen in neuronalen Berechnungen gespielt zu bestimmen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Borosilicate glass	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
Polyethylene tubing	Intramedic	PE205
Agar	Sigma-Aldrich	A7002
Low gelling temp agarose	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781