Summary
Эта процедура позволяет очистки фрагментов ДНК с высоким выходом.
Abstract
Очищенные фрагменты ДНК, которые используются для различных целей в области молекулярной биологии, и они могут быть получены несколько процедур. Большинство из них нуждаются в предыдущие электрофореза фрагментов ДНК для того, чтобы отдельные группы интересов. Затем эта полоса вырезали из геля агарозы или акриламида и очищают, используя либо: обязательные и элюирования из стекла или кварца частиц, ДЭАЭ-целлюлозы мембран, "раздавить и замочить метод", электроэлюцией или очень часто дорогие коммерческие комплекты очистки. Таким образом, выбор метода будет зависеть главным образом от того, что имеется в лаборатории. Электроэлюцией процедура позволяет очистить очень чистой ДНК, которые будут использоваться в большом числе приложений (секвенирование, радиоактивной метки, ферментативные ограничение, ферментативной модификации, клонирование и т.д.). Эта процедура состоит в размещении ДНК группа содержащих агарозы или акриламида срезы в образце скважин electroeluter, то, применяя текущей сделает фрагмент ДНК, чтобы оставить агарозы и таким образом оказаться в ловушке подушке соль, подлежащих возмещению позднее осаждением этанолом.
Protocol
- Для того чтобы выбрать фрагменты ДНК, представляющие интерес для быть очищены, они должны быть решены в агарозном или гели акриламида гель окрашивали бромидом этидия с помощью электрофореза использованием 0.5X буфера TBE (Трис борат, ЭДТА) на 120 вольт в течение 1 часа. Для этого, ~ 700 нг плазмидной pProEx-GdMre11S (6000-б.п.), ранее переваривают NdeI и HindIII был использован для выпуска 900-б.п. фрагмент (560 нг плазмидной и 84 нг фрагмент).
- Бак electroeluter (рис. 1) должны быть заполнены 0.5X КЭ равномерно распределенных в каждую сторону середины плато, заботясь о допускайте попадания ее на середину плато.
- Выбранного диапазона (или полос) вырезается из геля, и помещен в камеру с образцом как можно ближе к V канала (один ломтик на лунку). Запуск буфера должны быть добавлены к каждой камере, просто достаточно, чтобы покрыть геля.
- Каждый канал V использованы должен быть промыт пипетки Пастера, чтобы устранить любые пузырьки воздуха в ловушке.
- Затем 100 мкл 10 М NH 4 ацетат (для удобства представления небольшого количества бромфенолового синего добавляют ровно столько, чтобы цвет ее) мягко добавил внутри канала V.
- Крышка должна быть закрыта осторожно, чтобы предотвратить любые ресуспендирования высокой подушке соль.
- Электроэлюцией начинается при 100 вольт в течение 25 минут.
- Когда electrolution завершен, 400 ул удаляются из V-канал, и помещен в микроцентрифужную трубки должны быть осаждали 2 объемов холодного этанола и гликогена (рекомендуется для улучшения восстановления ДНК) при 4 ° С в течение 1 часа или на ночь.
- Центрифуга в течение 20 минут, удалите супернатант и промыть 70% этанолом.
- Сухая труба и количественно ДНК в ОП 260 нм.
- Восстановление получены составила 75% (63 нг восстановленные при 84 нг были размещены на V-канала).
Рисунок 1. Electroeluter диаграмме. Анод катода указаны на каждой стороне бака, ДНК, содержащейся в геле нарезанный (показано, как черный квадрат), будут мигрировать к катоду из-за его отрицательный заряд. Тогда это будет в ловушке соль подушке (представленных в виде перевернутой буквы черный треугольник), расположенный в V-канала.
Discussion
Продолжительность перспективе будет сильно зависеть от размера фрагментов, как правило, для осколков до 20 кб 50 минут до 1 часа достаточно, а для небольших фрагментов ультрафиолета мониторинг каждые 10 минут требуется для предотвращения фрагмент, чтобы пройти Подушка соль и, следовательно, к анодной камере буфера уменьшения восстановления. Важно, чтобы убедиться, что при установке блока питания на 100 вольт, то ток по крайней мере, 10 MAMP. ДНК группы можно контролировать с помощью УФ-лампы стороны и определить, когда это отказывается от геля. Подушка соли может быть также выполнена с 3 ацетат М Na.
Эта процедура позволяет очистки ДНК или РНК фрагменты разных размеров с хорошим восстановления (~ 80%), которые будут меченые, переваривается ферментами рестрикции, обработаны путем изменения ферменты и т.д.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа в лаборатории доктора Бермудес был профинансирован КОНАСИТ (грант № 82622). Мы благодарим Габриэлой Гутьеррес-Соса, Eliuth Рейес-Мартинес и Химена Родригес-Торрес для записи видео electroleution процедуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
