Summary
Deze procedure laat de zuivering van DNA-fragmenten met een hoog rendement.
Abstract
Gezuiverde DNA-fragmenten worden gebruikt voor verschillende doeleinden in Moleculaire Biologie en ze kunnen worden bereid door verschillende procedures. De meesten van hen vereisen een eerdere elektroforese van de DNA-fragmenten, om de band van belang te scheiden. Dan is deze band weggesneden uit een agarose-of acrylamide gel en gezuiverd door middel van: binding en elutie van glazen of silica deeltjes, DEAE-cellulose membranen, "crush en genieten methode", elektro of heel vaak dure commerciële zuivering kits. Zo zal het selecteren van een methode grotendeels afhankelijk zijn van wat er beschikbaar is in het laboratorium. De elektro-procedure maakt het mogelijk om te zuiveren zeer schoon DNA te worden gebruikt in een groot aantal toepassingen (sequencing, radiolabeling, enzymatische beperking, enzymatische modificatie, klonen etc). Deze procedure bestaat uit het plaatsen van DNA-band-bevattende agarose of acrylamide sneetjes in monster putjes van de electroeluter, dan is toepassing van de huidige zal het DNA-fragment op de agarose te verlaten en dus gevangen in een kussen zout zijn om later worden teruggevorderd door ethanolprecipitatie.
Protocol
- Met het oog op DNA-fragmenten van belang worden gezuiverd te selecteren, moeten deze worden opgelost in agarose gels of acrylamide gel gekleurd met ethidiumbromide door middel van elektroforese met 0.5X TBE buffer (Tris boraat, EDTA) bij 120 volt gedurende 1 uur. Voor deze, ~ 700 ng van het plasmide pProEx-GdMre11S (6000-bp) eerder verteerd met Ndel en HindIII werd gebruikt om een 900-bp fragment (560 ng van plasmide en 84 ng van het fragment) release.
- De electroeluter tank (figuur 1) moet worden gevuld met 0.5X TBE gelijk verdeeld aan elke kant van het midden van de plateau de verzorging van niet morsen het op het midden van de plateau.
- De geselecteerde band (of banden) wordt gesneden uit de gel, en geplaatst in monsterkamer zo dicht mogelijk bij de V-kanaal (een slice per putje). Running buffer moet worden toegevoegd aan elke kamer; net genoeg om de gel slice te dekken.
- Elke gebruikte V kanaal moet worden gespoeld met een Pasteur pipet aan een ingesloten luchtbel te elimineren.
- Dan 100 ul van 10 M NH 4-acetaat (voor visualisatie te vergemakkelijken een kleine hoeveelheid broomfenolblauw is toegevoegd, net genoeg om het kleur) worden voorzichtig aan de binnenzijde van de V-kanaal.
- Het deksel moet voorzichtig worden gesloten voor een resuspensie van de hoge zoute kussen te voorkomen.
- Elektro is begonnen op 100 volt voor 25 minuten.
- Wanneer electrolution is voltooid, worden 400 ul verwijderd van V-kanaal, en geplaatst in een microfugebuis te worden neergeslagen met twee volumes van de koude ethanol en glycogeen (aanbevolen om DNA herstel te verbeteren) bij 4 ° C gedurende 1 uur of 's nachts.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten, verwijder supernatant en wassen met 70% ethanol.
- Droge buis en te kwantificeren DNA bij OD 260 nm.
- Verkregen Het herstel was 75% (63 ng hersteld toen 84 ng werden geplaatst op de V-kanaal).
Figuur 1. Electroeluter diagram. Geanod een kathode worden aangegeven op elke kant van de tank, DNA in gel gesneden (geïllustreerd als een zwart vierkant) zal migreren naar de kathode als gevolg van de negatieve lading. Dan zal het gevangen zitten in het zout kussen (voorgesteld als een omgekeerde zwarte driehoek) gelegen in het V-kanaal.
Discussion
De duur van de termijn zal sterk afhangen van de grootte van de fragmenten, die normaal voor de fragmenten van maximaal 20 kb 50 minuten tot 1 uur is genoeg, terwijl voor kleine fragmenten UV-licht controle op elke 10 minuten is vereist om het fragment te voorkomen om door de zout kussen en bijgevolg de anodal buffer kamer afnemende herstel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat wanneer u uw voeding op 100 volt, is er een stroom van ten minste 10 MAMP. De DNA-band kan worden gecontroleerd met behulp van een UV-lamp en de hand detecteren wanneer dit verlaat de gel slice. Het kussen zout kan ook gemaakt worden met 3 M Na-acetaat.
Deze procedure laat de zuivering van DNA of RNA-fragmenten van verschillende afmetingen met een goede recovery (~ 80%), voor radioactief, verteerd door restrictie-enzymen, verwerkt door aanpassing van enzymen, etc.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Werk in Dr Bermudez laboratorium werd gefinancierd door Conacyt (Grant # 82622). Wij danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez en Ximena Rodriguez-Torres voor video-opname van de electroleution procedure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
