Summary
هذا الإجراء يسمح للتنقية مع شظايا الحمض النووي عالية الغلة.
Abstract
وتستخدم شظايا من الحمض النووي لأغراض مختلفة المنقى في البيولوجيا الجزيئية ، ويمكن أن يكونوا مستعدين من خلال إجراءات عدة. معظمها تتطلب الكهربائي السابقة للشظايا من الحمض النووي من أجل فصل عصابة من الفائدة. ثم ، يتم رفعه من هذه الفرقة من agarose هلام أو الأكريلاميد وتنقيتها باستخدام إما : ملزمة وشطف الزجاج أو من جزيئات السيليكا ، والأغشية ثنائي إيثيل أمينو إيثيل السليلوز ، "سحق ونقع الأسلوب" ، electroelution أو في كثير من الأحيان مكلفة تنقية مجموعات تجارية. وبالتالي ، فإن اختيار الأسلوب يعتمد في الغالب على ما يتوفر في المختبر. الإجراء electroelution يسمح احد لتنقية الحمض النووي نظيفة جدا لاستخدامها في عدد كبير من التطبيقات (التسلسل ، radiolabeling ، وتقييد الأنزيمية ، وتعديل الأنزيمية ، الخ الاستنساخ). يتكون هذا الإجراء في وضع الحمض النووي الفرقة التي تحتوي على مادة الأكريلاميد agarose أو شرائح داخل الآبار عينة من electroeluter ، ثم تطبيق الحالية سيجعل جزء الحمض النووي لمغادرة agarose وبالتالي يكون محاصرا في وسادة الملح التي سيتم استردادها في وقت لاحق عن طريق الترسيب الايثانول.
Protocol
- من أجل اختيار شظايا من الحمض النووي التي تهم يمكن تنقيته ، ينبغي حل هذه agarose في المواد الهلامية أو هلام ملون الأكريلاميد مع بروميد إيثيديوم بواسطة الكهربائي باستخدام العازلة 0.5X TBE (تريس بورات ، EDTA) عند 120 فولت لمدة 1 ساعة. وقد استخدم لهذا ، ~ 700 نانوغرام من البلازميد pProEx GdMre11S - (6000 - BP) هضمها من قبل مع وNdeI HindIII على الافراج عن 900 قطعة من الغليان (560 نانوغرام من البلازميد و 84 نانوغرام في جزء منه).
- ينبغي أن تملأ خزان electroeluter (الشكل 1) مع 0.5X TBE موزعة بالتساوي في كل جانب من الهضبة منتصف رعاية لا صرفها على هضبة متوسطة.
- يتم قطع الشريط المحدد (أو نطاقات) للخروج من هلام ، وتوضع في حجرة العينة أقرب وقت ممكن إلى القناة الخامسة (شريحة واحدة لكل بئر). وينبغي أن يضاف إلى المخزن تشغيل كل غرفة ، ما يكفي لتغطية شريحة هلام.
- يجب أن يتم مسح كل قناة V استخدامها مع ماصة باستور للقضاء على أي فقاعة الهواء المحبوس.
- ثم تضاف برفق 100 من المجاهدين 10 M خلات NH 4 (لتسهيل التصور يتم إضافة كمية صغيرة من اللون الأزرق bromophenol ، وهو ما يكفي فقط لأنه لون) داخل القناة الخامس.
- يجب إغلاق الغطاء برفق لمنع أي إعادة تعليق من الملح وسادة عالية.
- وبدأت في Electroelution 100 فولت لمدة 25 دقيقة.
- عند اكتمال electrolution ، تتم إزالة 400 من المجاهدين V - القناة ، ووضعها في أنبوب microfuge أن تكون عجلت مع 2 مجلدات من الايثانول الباردة والجليكوجين (مستحسن لتحسين استرداد DNA) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة ، ويغسل إزالة طاف مع الايثانول 70 ٪.
- أنبوب الجافة وتحديد الحمض النووي في 260 نانومتر OD.
- وكان الانتعاش الحصول على 75 ٪ (63 نانوغرام تعافى عندما وضعت 84 نانوغرام في قناة V -).
الشكل 1. Electroeluter الرسم التخطيطي. واشارت الى أنود الكاثود على كل جانب من الحمض النووي ، خزان الواردة في جل شرائح (كما هو موضح مربع أسود) سوف تهاجر نحو الكاثود بسبب شحنتها السالبة. ثم سيتم المحاصرين في وسادة الملح (ممثلة مثلث مقلوب سوداء) الموجود في V - القناة.
Discussion
ومدة تشغيل تعتمد بشكل كبير على حجم الشظايا ، شظايا عادة لمدة تصل إلى 20 كيلو بايت 50 دقيقة إلى 1 ساعة ويكفي ، في حين أن أجزاء صغيرة مطلوب ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمتابعة كل 10 دقائق لمنع شظية من خلال الذهاب الى وسادة الملح وبالتالي الى الغرفة العازلة مصعدي انخفاض الانتعاش. فمن المهم للتأكد من أنه عند تعيين إمدادات الطاقة الخاص في 100 فولت ، وهناك ما لا يقل عن mAmp الحالية من 10. يمكن رصد الفرقة الحمض النووي باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية من ناحية وكشف هذا عندما يتخلى عن شريحة هلام. يمكن أيضا أن تكون وسادة الملح مع 3 خلات نا م.
هذا الإجراء يسمح radiolabeled تنقية شظايا الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من أحجام مختلفة مع انتعاش جيدة (~ 80 ٪) ، هضمها بواسطة إنزيمات التقييد ، التي تتم معالجتها بواسطة الانزيمات تعديل ، إلخ.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل الدكتور برموديز CONACYT (المنحة # 82622) ، ونشكر غابرييلا جوتيريز ، سوسا ، Eliuth رييس - مارتينيز ورودريغيز زيمينا توريس لتسجيل الفيديو الإجراء electroleution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
