Summary
Questa procedura permette la purificazione di frammenti di DNA con alto rendimento.
Abstract
Frammenti di DNA purificati vengono utilizzati per scopi differenti in Biologia Molecolare e possono essere preparati con procedure diverse. La maggior parte di essi richiedono una precedente elettroforesi dei frammenti di DNA al fine di separare la banda di interesse. Poi, questa band è escisse fuori da un gel di agarosio o acrilamide e purificate utilizzando: vincolanti e eluizione di particelle di vetro o di silice, DEAE-cellulosa membrane, "cotta e immergere metodo", electroelution o molto spesso costosi kit di purificazione commerciale. Così, la selezione di un metodo dipende per lo più di ciò che è disponibile in laboratorio. La procedura electroelution permette di purificare il DNA molto pulito per essere utilizzato in un gran numero di applicazioni (sequenziamento, radiomarcatura, restrizione enzimatica, modificazione enzimatica, ecc clonazione). Questa procedura consiste nel mettere DNA banda contenenti fette di agarosio o acrilamide nei pozzetti campione del electroeluter, allora in corso l'applicazione farà il frammento di DNA di lasciare l'agarosio e quindi essere intrappolati in un sale cuscino da recuperare in seguito dalla precipitazione dell'etanolo.
Protocol
- Al fine di selezionare frammenti di DNA di interesse da depurare, questi dovrebbero essere risolti in gel di agarosio o acrilamide gel colorati con bromuro di etidio tramite elettroforesi utilizzando tampone TBE 0.5X (Tris borato, EDTA) a 120 volt per 1 ora. Per questo, ~ 700 ng di plasmide pProEx-GdMre11S (6000-bp) precedentemente digerito con NdeI e HindIII è stato utilizzato per rilasciare un frammento di 900-bp (560 ng di plasmide e 84 ng di frammento).
- Il serbatoio electroeluter (Figura 1) devono essere riempiti con TBE 0.5X equamente distribuiti in ogni parte del plateau metà avendo cura di non versare sul pianoro a metà.
- La band selezionate (o bande) è tagliato fuori dal gel, e posto in camera di campione il più vicino possibile al canale V (una fetta per pozzetto). Tampone di corsa deve essere aggiunto ad ogni camera; appena sufficiente a coprire la fetta gel.
- Ogni canale V utilizzati deve essere lavata con una pipetta Pasteur per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate.
- Allora 100 ul di 10 M NH 4 acetato (per facilitare la visualizzazione una piccola quantità di blu di bromofenolo si aggiunge, quanto basta per colorarlo) sono gentilmente aggiunti all'interno del canale V.
- Il coperchio deve essere chiuso delicatamente per evitare la risospensione del cuscino di sale.
- Electroelution è iniziato a 100 volt per 25 minuti.
- Quando electrolution è completato, 400 ul vengono rimossi dal V-canale, e messo in una provetta per microcentrifuga da precipitare con 2 volumi di etanolo freddo e glicogeno (consigliato per migliorare il recupero del DNA) a 4 ° C per 1 ora o durante la notte.
- Centrifugare per 20 minuti, rimuovere il surnatante e lavare con etanolo al 70%.
- Tubo secco e quantificare il DNA a OD 260 nm.
- Il recupero ottenuto è stata del 75% (63 ng recuperato 84 ng quando sono stati immessi sul V-canale).
Figura 1. Diagramma Electroeluter. Anodizzato un catodo sono indicati su ogni lato del serbatoio, il DNA contenuto nel gel a fette (illustrato come un quadrato nero) migreranno verso il catodo a causa della sua carica negativa. Allora sarà intrappolato nel cuscino sale (rappresentato come un triangolo rovesciato) che si trova nel V-canale.
Discussion
La durata della corsa dipenderà fortemente dalle dimensioni dei frammenti, normalmente per frammenti fino a 20 kb 50 minuti a 1 ora è sufficiente, mentre per i piccoli frammenti di luce UV monitoraggio ogni 10 minuti è necessaria per evitare il frammento di passare attraverso il cuscino di sale e di conseguenza alla camera di buffer di anodica diminuzione di recupero. E 'importante assicurarsi che quando si imposta l'alimentazione a 100 volt, c'è una corrente di almeno di 10 mAmp. La banda del DNA può essere monitorato tramite una lampada UV-mano e rilevare quando questa abbandona la fetta gel. Il sale cuscino può essere fatta anche con 3 M Na acetato.
Questa procedura permette la purificazione di frammenti di DNA o RNA di diverse dimensioni con un buon recupero (~ 80%) da radiomarcato, digerito dagli enzimi di restrizione, trattati con enzimi che modificano, ecc
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Lavoro in Dr. Bermudez laboratorio è stato finanziato dalla Conacyt (Grant # 82622). Ringraziamo Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez e Ximena Rodriguez-Torres per la registrazione video della procedura electroleution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 acetate | JT Baker | 0596 | |
| agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr–luter | IBI | UEA CAT 46000 |
References
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
