Summary
Nya värd faktorer som virusinfektion kan identifieras genom cellbaserade genomet hela förlust av funktion RNAi screening. En
Abstract
Virala patogener utgör en betydande hot mot folkhälsan, inte bara kan virus orsaka naturliga epidemier av sjukdomar hos människan, men deras potentiella användning i bioterrorism är också ett bekymmer. En bättre förståelse av de cellulära faktorer som påverkar infektionen skulle underlätta utvecklingen av välbehövlig terapi. Senaste framstegen inom RNA-interferens (RNAi) teknik i kombination med kompletta genomet sekvensering av flera organismer har lett till optimering av genomet hela, cellbaserade förlust-av-funktionen skärmar. Drosophila celler är speciellt mottagliga för arvsmassan skala skärmar på grund av underlätta och effektivisera RNAi i detta system 1. Viktigare, kan en mängd olika virus infekterar Drosophila celler, inklusive ett antal däggdjur virus av medicinska och jordbruk betydelse 2,3,4. Tidigare RNAi skärmar i Drosophila har identifierat värd faktorer som krävs för olika stegen i virus infektion inklusive inträde, översättning och RNA-replikering 5. Dessutom är många av de cellulära faktorer som krävs för virusreplikation i Drosophila cellkultur begränsar också i mänskliga celler infekterade med dessa virus 4,6,7,8, 9. Därför presenterar identifiering av värd faktorer som adjungerad under virusinfektion nya mål för antivirala läkemedel. Här presenterar vi en generell protokoll för en hög genomströmning RNAi skärmen för att identifiera cellulära faktorer som virusinfektion, med hjälp av vaccinia virus som exempel.
Protocol
Del 1: RNAi i 384 brunnar
- Standardisering av de reagens som används för screening är nödvändig. Vi testar enskilda delar av Schneiders medier, fetalt bovinserum och reagens färgning. Då har vi uppmätt och använder samma parti för hela skärmen.
- För varje analys är det bäst att testa flera olika cellinjer för att avgöra vilken som är mest mottaglig för din biologiska avläsning. Vi använder vanligtvis S2-DRSC linje.
- Väx Drosophila celler vid 25 ° C i fullständig Schneiders medier.
- Schneiders media
- 10% värmeinaktiverad FBS
- 1X L-glutamin
- 1X Penna / Strep antibiotika
- Drosophila celler är semi-anhängare och är passerats utan trypsinization var fjärde dag genom att pipettera cellerna från kolvarna och späda cellerna 1:10 in i en ny kolv. Celler ska vara i loggen fas för experiment.
- Plate-till-plåt och dag till dag variation minimeras genom att använda automatiserad vätskehantering för alla flytande tillägg till flera bra plattor. Vi använder en WellMate (Matrix).
- Förbered WellMate slangen.
- Sprayhood och WellMate med 70% etanol.
- Ta bort slangen från förpackningen och spray med 70% etanol.
- Sätt slangen kassetten i dispensering position på WellMate.
- Prime slangen med 25 ml 70% etanol.
- Sterilisera slangar i etanol i 15 minuter, sedan Grunda med ytterligare 25 ml etanol.
- Skölj slangen genom grundning med 50 ml steril PBS.
- Få bort celler från kolv och räkna. Pellets celler så att du har 25% mer än vad som behövs (300xg, 5 min). Antalet celler seedade per brunn måste optimeras enligt analysen längd. Vid genomförande av automatiserad bildanalys, är en enda monolager utan cell klumpar idealisk för bild segmentering.
- Resuspendera pelleterat cellerna i serumfritt Schneiders media på 1.7x10 6 celler / ml.
- Vi utför skärmen i 384 brunnar före alikvoteras med ett kommersiellt tillgängligt bibliotek med dsRNA vid en koncentration av 250ng/well. Flera brunnar på varje platta lämnas tomma för kontroller, som läggs till manuellt. Vi använder dsRNA till luciferas som negativ kontroll. Vi använder dsRNA mot tråd (dIAP) som en kontroll för robust RNAi. Slå ner den här anti-apoptotiska faktor resulterar i dramatiska celldöd och är en sammanfattning av visuellt sätt att bedöma kvaliteten på de slå ner. Slutligen använder vi en dsRNA mot virus reporter, i detta fall beta-galacosidase, som en positiv kontroll för att bekräfta att vi kan hämma virusinfektion med vår analys avläsning. Om spotting dsRNA i plåten vid cellens sådd, uppmätt 1 l dsRNA in i hörnet av brunnen för att möjliggöra enklare visualisering, centrifugera dsRNA på botten av bra (300xg, 1 min) innan du lägger till celler.
- Använd WellMate att lägga till 10 mikroliter celler beredd ovan i varje brunn.
- Spin celler på tallrikar genom att centrifugera 300xg, 1 min.
- Inkubera i 25 ° C inkubator i 45 minuter.
- Tillsätt 20 mikroliter komplett Schneiders media och centrifugera 300xg, 1 min.
- Placera plattorna i fuktad Tupperware behållare fodrad med vattniga hushållspapper. Volymen på en 384 är väl liten, alltså, kan avdunstningen har stora effekter på biologi, vilket i sin tur kan leda till artefaktuella förändringar i läs-outs av kanten brunnar. För att övervinna detta bör tallrikar upprätthållas under hög luftfuktighet.
- Inkubera i tre dagar för att möjliggöra för robust knockdown. Det finns ingen anledning att ändra media eller öppna fuktas kärl under denna tid.
Del 2: infekterar med vaccinia virus
- Sterilisera flerkanaligt aspirator i Quatricide i 15 minuter och skölj sedan i 70% etanol.
- Förbered WellMate som beskrivs ovan.
- Förbered Schneiders media med 2% FBS för infektion genom att späda komplett media 01:05 i serum fria medier.
- Filtrera rå virus aktien genom 0,8 um sprutfilter att ta bort cellulärt skräp eller använda renat virus.
- Späd vaccinia virus i 2% serum Schneiders media för att få mångfald av infektion (MOI) 2.
- Ta bort PBS från WellMate slangar och prime med utspädd virus förrän slangen är fri från luftbubblor.
- Använd steriliserade flerkanaligt aspirator och vakuum grenrör att försiktigt ta bort media från plåtar dsRNA behandlade Drosophila celler.
- Tillsätt 30 mikroliter virus per brunn på tallrikar med WellMate.
- Centrifugera tallrikar 1 minut vid 300xg.
- Sterilisera WellMate slangen. Grunda med 25 ml 10% blealm, vänta 10 minuter och prime med ytterligare 25 ml 10% blekmedel.
- Prime slangen med 50 ml vatten följt av 50 ml 70% etanol. Återgå slang till dess förpackning.
- Återgå plattorna befuktas Tupperware behållare. Inkubera vid 25 ° C i 48 timmar.
Del 3: Färgning Plattor
- Fix plattor i 15 mikroliter 4% formaldehyd / PBS i 10 minuter. Vätska tas bort med hjälp av en flerkanalig aspirator och vakuum grenrör vid varje steg. När plattorna har fastställts, steril utrustning och reagens inte längre behövs.
- Ta bort fix och använda WellMate att lägga till 30 mikroliter PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Inkubera 10 minuter och upprepa. Kör WellMate som beskrivits ovan, förutom slangen inte behöver steriliseras.
- För att upptäcka vaccinia infektion använder vi en β-galaktosidas reporter som drivs av ett tidigt / sent vaccinia promotor.
- Ta bort vätskan och inkubera celler i blocket (PBST med 2% BSA) i 10 minuter.
- Späd primära antikroppen i block, ta bort vätskan och lägg till 15 mikroliter antikropp till varje brunn med en flerkanalig upprepa pipett (Matrix).
- Spinn ner plattor (300xg, 1 min), täck med en tydlig dekal och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Ta bort primära antikroppen och använd WellMate att tvätta brunnar i PBST 3 gånger, 10 minuter vardera.
- Späd fluorescerande sekundär antikropp (FITC) och nukleära fläck i block, och lägg till 15 mikroliter till brunnarna med en flerkanals pipett upprepa.
- Inkubera plattorna 1 timme vid rumstemperatur, skyddat för ljus.
- Tvätta brunnarna i PBST 3 gånger 10 minuter vardera med WellMate.
- Täta plattan med tydlig dekal, täck och förvara vid 4 ° C upp till tre veckor.
Del 4: bildsystem och bildanalys
- Använd ett automatiserat mikroskop på 20X förstoring för att Bildbrickor.
- Ta bilder av det totala kärnor (DAPI) och infekterade celler (FITC). Optimera exponeringstid för varje kanal individuellt för att maximera dynamiskt omfång.
- Finjustera den automatiska fokus funktionen genom att ta en Z bunt bilder, placerade 1um mellanrum, som sträcker sig över planen ovanför och under det förväntade plan fokus. När den optimala fokalplanet ligger, justera autofokus inställningar därefter.
- Bild på hela plattan, fånga minst tre bilder per väl i både Hoechst kanal (DAPI) och viruset kanal (FITC). Välj webbplatser från flera olika regioner i en brunn för att fånga bilder som representerar såväl som en helhet.
- Använd MetaXpress programvara för att skriva en dagbok att segmentera bilden och använda moduler Räkna Nuclei att beräkna det totala antalet celler positivt för nukleär färgning (totalt celler) och infektion (FITC) för varje platta.
- Beräkna procent infektion (100 * FITC positiv / totalt celler) och logga omvandla.
- För att identifiera kandidater använder vi en robust Z poäng baserad på median och interkvartilt intervall på varje platta. Denna metod är okänslig för extremvärden och icke-symmetriska data, och därmed ger större kraft i att identifiera och med svag eller måttlig träffar 10. För varje platta, är medianen subtraheras från log-transformerade data. Sedan de resulterande värdena divideras med 0,74 gånger interkvartilt intervall (skillnaden mellan värdena för de 75: e percentilen och den 25: e percentilen). Den 0,74 faktorn används för att approximera en standard normalfördelning.
- Den robusta Z poäng är ett mått på avståndet i standardavvikelser från medianen av plattan. Till exempel visar en robust Z-score av 2 i% infektion i väl ~ 2 standardavvikelser från plattan medianen eller p <0,05.
- Analysera mobilnummer för att identifiera cytotoxiska kandidater. Beräkna robusta Z värdering av kärnkraft räknas. Kandidater med en robust Z <-2 i två exemplar skärmar anses cytotoxiska.
- Brunnar som har en robust Z-poäng för procent infektion i> 2 eller <-2 i två exemplar skärmar (p <0,0025) utan cytotoxicitet anses vara potentiella kandidater från den primära skärmen.
- Positiva kandidater valideras med hjälp av oberoende reagenser. dsRNAs genereras mot gener av intresse från en annan region av mRNA och testade enligt ovan.
- De gener som två oberoende dsRNAs har samma fenotyp kan komma ifråga för vidare studier.
Del 5: Representant bilder och tolkning av infektioner
Figur 1. Oinfekterade brunnar visar ingen färgning för vaccinia virus proteiner, samtidigt som en företrädare infekterade och innehåller celler färgning positivt för vaccinia uttrycks-beta-galaktosidas (βgal) protein, mätt med immunofluorescens mikroskopi.Virus = grön, kärnor = blå.
Figur 2. Automatiserad bildanalys programvara kvantifierar infektion i varje bild med hjälp av parametrar som användaren. I en representativ bild, är det totala antalet cellkärnor och antalet celler som uttrycker virusantigen räknade baserat på storlek och intensitet färgning över den lokala bakgrundsfärgning.
Figur 3. Knockdown av tråd (dIAP) fungerar som en positiv kontroll för robust RNAi utarmning av mål gener. ÖVERVÄLDIGANDE av denna anti-apoptotiska faktor leder till en dramatisk celldöd. Nuclei = blå.
Figur 4. Knockdown av luciferas fungerar som en negativ kontroll för effekten av dubbelsträngat RNA behandling på infektion. Utarmning av luciferas har ingen effekt på infektionen i förhållande till celler lämnas obehandlade. Virus = grön, kärnor = blå.
Figur 5. Knockdown av βgal protein fungerar som en positiv kontroll för att minska infektion, eftersom analysen använder βgal protein nivåer som läste upp för infektion. Utarmning av βgal resulterar i en minskning av andelen infekterade celler. Virus = grön, kärnor = blå.
Figur 6. Knockdown av cellulär faktor Rab5 resulterar i en minskning av andelen infekterade celler. Eftersom Rab5 är känt för att delta i endocytos, bidrar denna faktor sannolikt vaccinia virus inträde. Detta är ett exempel avvikare från skärmen. Virus = grön, kärnor = blå.
Discussion
Genomvid RNAi screening i Drosophila ger en robust och effektiv metod för att undersöka de cellulära delen av virusinfektion. Ett antal däggdjur virus infekterar Drosophila celler, som kan användas för att identifiera komponenter i den mottagande inneboende immunförsvaret, och värd faktorer protein som behövs för virusreplikationen som kan representera nya terapeutiska mål. Innan du utför en skärm, måste analysen noggrant optimerad för celltyp, mobilnummer, och infektion nivå, och måste vara väl kontrollerad, både positiva och negativa virala och cellulära mål 11. Det är viktigt att säkerställa ett tillräckligt avstånd mellan positiva och negativa kontroller före screening för att maximera det dynamiska omfånget av analysen. När skärmen har utförts, kan de sökande delas in i funktionella kategorier för att avgöra vilken värd mekanismer bidrar till infektion. För däggdjur virus såsom vaccinia, bör bidraget från däggdjur homologer av RNAi bestämmas som en del av sekundär analys. Sammantaget kommer dessa robusta screeningmetoder möjligt för oss att få insikt i komplexa mekanismer genom vilka virus interagerar med sina värdceller.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIAID (R01AI074951, U54AI057168) och Penn Genome gränser institutet till SC, från NIH T32HG000046 till TSM, från NIH T32GM07229 och T32AI007324 till LRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Schneider’s media | GIBCO, by Life Technologies | 11720 | |
| GlutaMAX 100X | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Screening | |||
| Genome-wide dsRNA library | Ambion | ||
| 384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | |
| Aluminum seals | Corning | 6569 | |
| Clear seals | Denville Scientific | B1212-4 | |
| Well Mate | Matlab | 201-10001 | |
| 24 pin manifold | Drummond Scientific | 3-000-101 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | ||
| ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | ||
| MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |
References
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).
- Chotkowski, H. L. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication. J Virol. 62, 277-284 (1988).
- Sessions, O. M. Discovery of insect and human dengue virus host factors. Nature. 458, 1047-1050 (2009).
- Cherry, S. Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions? Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).
- Hao, L. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Cherry, S. COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication. PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).
- Cherry, S. Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition. Genes Dev. 19, 445-452 (2005).
- Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics. PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).
