Summary
Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri, gerekli tüm hücresel süreçlerin bir işaretidir. Ancak, bu etkileşimlerin birçok co-immunoprecipitation gibi geleneksel biyokimyasal yöntemlerle belirlenmesi ve analiz önlenmesi, geçici ya da enerjik zayıf. Bu bağlamda, genetik encodable floresan proteinleri (GFP, TTT, vs) ve floresans spektrumu örtüşen ilişkili Förster rezonans enerji transferi (FRET) 1-3 kullanarak in vivo olarak zayıf etkileşimleri izlemek için yeteneğimizi devrim yarattı. Burada, endotel hücre yüzeyinde reseptör-reseptör etkileşimlerinde izlenmesi için bir FRET tabanlı yakınlık testinin detaylı kullanımı.
Protocol
Protokol üç önemli adımlar oluşur. Memeli bir ifade amino-terminal CFP ve / veya YFP monomerik sürümleri için vektör sadece kısa bir süre tartışılan olacaktır ilgi gen ilk adım klonlama. Ikinci ve üçüncü adımları EA.hy926 endotel hücreleri içine vektör DNA transfeksiyon ve FRET ile konfokal görüntüleme, daha derinlemesine aşağıda özetlenmiştir.
1. OBP ve YFP Kimerik Reseptörler İnşaatı
Ilgi Reseptörler CFP ve YFP monomerik gelişmiş versiyonları için amino-terminal klonlanmış olmalıdır. FRET, belirlenmesi, deneysel ve eleştirel transmembran bölgeye yayılan ve fluorofor 1 başlaması arasında ilintileyici uzunluğu üzerine bağlıdır . Bu nedenle, birkaç farklı uzunluklarda ilintileyici soruşturma altında her yeni reseptör çifti için araştırılmalıdır.
- Monomerik C veya YFP (bu vektör laboratuarımızda elde edilebilir) içeren pcDNA3.1 rutubet R ya da neo R vektör içine NheI / EcoRI sitelerine ilgi reseptör klonu. * Not Gerekirse, NheI SpeI ve XbaI dahil uyumlu diğer birçok enzimler.
- Uygun bir endA1 reca yetkili hücre hattı (rutin Mach1 kullanmak) ligasyon reaksiyonu dönüştürün. Ekran kolonilerin varlığı eklemek için DNA mutasyonlarının yokluğunda doğrulamak için sıralama tarafından izledi.
- Başarılı moleküler klonlama konformasyon elde edilmesi üzerine, Qiagen, ya da benzer DNA kitleri kullanılarak steril su veya TE transfeksiyon dereceli vektör DNA hazırlamak. UV spektroskopisi kullanarak, konsantrasyon ve saflık değerlendirin. DNA tipik verim 100-200 mikrogram, rutin bir çalışma stok 1 mcg / ml 'ye seyreltilerek aralığında olmalıdır.
2. EA.hy 926 Hücreler, Transfeksiyon
- Mattek lamel (0) sayılı, 2 ml orta 35 mm yemekleri tam-DMEM yetişen EA.hy 926 hücreler 4, (% DMEM 10 fetal sığır serumu + Pen. / Strep.) Böl . Konservatif bir konfluent çanak 15 cm ~ 15 yemekleri (~% 90 konfluent ertesi gün) elde edebilirsiniz. Her bir reseptör ifade yanı sıra her alıcı çifti için bir çanak değerlendirmek için bir tabak hazırlayın.
- Hücrelerin 37% 5 CO 2 atmosferde gece boyunca inkübe İzin ° C Ertesi gün, kültürleri, ~% 70-90 konfluent olmalıdır.
- Transfeksiyon gün, Fugene6 8 mcL kimerik reseptör vektör DNA (2 mcL) 2 mg, önceden ısıtılmış OptiMEM 200 mcL karıştırılarak nucleolipid kompleksleri hazırlayacak. Reseptör çiftleri için, her reseptör 2 mikrogram toplam 1 mcg transfect (aşağıya tartışma bakın).
- Tersine çevirerek yavaşça karıştırın.
- 30 dakika oda sıcaklığında inkübe devam edin.
- Kuluçka dönemi sırasında, hücrelerin transfeksiyon için hazırlamak. Taze medya aspire ve antibiyotik olmadan önceden ısıtılmış 2 mL tam-DMEM (DMEM + FBS) ilave önce sıcak PBS ile hafifçe ve kısaca her plaka yıkayın. Fugene6 ile tedavi sırasında hücrelere çok daha fazla toksik olduğu, Penisilin ve Streptomisin varlığını önlemek için önemlidir.
- Hücrelere bilge karmaşık damla ekleyin ve ek bir 20-24 saat boyunca inkübe 37 ° C,% 5 CO 2 atmosfer .
- 24 saat sonra hücrelerin, dikkatlice medya aspirat ve antibiyotikler ile taze tam DMEM pipetle. Transfeksiyon sonra, hücre canlılığı nispeten yüksek kalmalıdır, yani hiçbir kayan hücreleri çok az dikkat edilmelidir.
- Gen ifadesi, genellikle ek bir 48-60 saat sonrası transfeksiyon sonra maksimum. Ancak, görüntüleme, 24 saat gibi kısa bir tipik olarak uygulanabilir. En iyi gen ekspresyonu için zaman ders deneyler yapılmalıdır.
3. Konfokal Görüntüleme ve Analiz FRET
Canlı hücre görüntüleme mavi diyot (405 nm), Argon (458, 476, 488, 514 nm) ile donatılmış bir Leica TCS SP2 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor konfokal lazer tarama mikroskobu yapılır. yeşil HeNe (543 nm), turuncu HeNe (594 nm), ve kırmızı HeNe (633 nm) lazerler, bir HCX PI Apo 63x/1.3 na gliserin daldırma objektif lens, bir motorize XY (Märzhäuser) ve çevre kontrollü ( sıcaklık, nem ve CO 2) evre inkübatör (Pecon). Deneysel kontrolleri fluorofor emisyon kanallarının yanı sıra, değerlendirmek ifade sorunları ve non-spesifik fluorofor multimerization arasında çapraz tartışma ortadan kaldırmak için kritik öneme sahiptir. Gibi, tek fluorofor transfections her görüntü oturumu kurmak için kullanılmaktadır. Negatif kontroller (bilinen noninteracting reseptörleri kullanarak), arka plan belirlemek amacıyla yapılacak gerekecektir FRET FRET aşırı ifade nedeniyle oluşur.
- CFP YFP için emisyon kanallar arasında crosstalk ortadan kaldırmak için, CFP ifade kontrol sahne kuvöz içine yerleştirin. Beyaz ışık kullanarak, odaklanmak için Z plaka ayarlamakhücrelere.
- CFP 465-505 nm ve 525-600 nm YFP emisyon algılama SP pencere ayarları ayarlayın.
- Hem de emisyon kanalları izleme, 458 nm'de CFP heyecanlandırmak. AOTF kullanarak, YFP emisyon kanal içine CFP üzerinde kayda değer bir sızdırma ortadan kaldırmak için lazer güç ayarlayın. Bu ayarı kaydedin.
- Sadece YFP ifade hücreleri için 514 nm uyarma gücü ayarlayarak CFP kanal YFP karışma (YFP ifade kontrolü kullanarak) aynı kontrol gerçekleştirin. Bu ayarı kaydedin.
- Sonraki yerde hücrelerin ortak ifade, sahne kuvöz içine CFP ve YFP. Leica konfokal yazılımı için sıra ayarını kullanarak, CFP ve YFP uygun membran lokalizasyonu ile benzer seviyelerde ifade hücrelerin bulun.
- Leica yazılım acceptor fotoğraf beyazlatma programı kullanarak, respectably, kaydedilmiş CFP ve YFP ayarları donör ve alıcı ayarlarını.
- Zoomlama hücre, hücre zarının meydana gelen ve programa başlamak için YFP fotoğraf yok olduğu bir yatırım getirisi (faiz bölge) vurgulayın.
- Acceptor fotoğraf imhası için% 100, 514 nm'de AOTF ayarlamak ve YFP emisyonu% 70 tükendiği kadar devam beyazlatma lazer izin. Beyazlatma hızlandırmak için, ROI'ler genellikle lazer tarama ekseni (X-ekseni) seçilir.
- Foto-beyazlatma sırasında, bu ölçümler, sahte verimlilik FRET rapor gibi, hücresel hareketi izlemek ve XY düzleminde kayda değer bir hareketi ile elde edilen ölçümler reddetmek.
- Donör (OBP) ve alıcı (YFP) için, öncesi ve sonrası-bleach görüntüleri kaydedilmiş ve verimlilik gibi hesaplanır FRET: Bütün D Mesaj> D öncesi D ön Verim = (D post-D ön) / D post FRET ve D sonrası sırasıyla photobleaching önce ve sonra donör yoğunluğu.
- JMP Yazılım (SAS), deneysel değişkenlik boyutunu belirlemek için kullanılır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Transfeksiyon verimleri% 30 ila% 40 arasında genellikle. Başkaları tarafından önceki bulgulara rağmen, bir vektör ve ifade transfeksiyon diğer yana olduğunu görmedim. Gerçekten de, sık sık bir fluorofor chimera veya diğer özel ifade gözlemlemek. Tipik verimleri reseptör sistemleri arasında değişir FRET. Tie reseptör sistemi için tipik değerler için% 20-28 epitel hücreleri ve endotel hücreleri% 19-23. Negatif kontroller için tipik verimliliği% 2-3 altında. Değişkenlik ölçüde deneyimi ile büyük ölçüde azalacak.
Şekil 1. Transfekte EA.hy 926 hücreler Temsilcisi görüntüler. EA.hy 926 hücre tek tabaka A) DIC görüntü. B) (A) görüntülenen hücreler Floresans görüntüsü. C) Overlay (A) ve (B) gösteren ~% 20-30 transfeksiyon verimliliği.
Şekil 2. Temsilcisi acceptor CFP YFP arasında bir EA.hy926 hücrede meydana gelen FRET analizi fotoğraf beyazlatma CFP emisyon kanal (üst paneller) ve YFP emisyon kanal (alt iki panel) önce ayrı ayrı izlenir ve yazılan acceptor photobleaching . Photobleaching deneylere sınırlı ve yeşil kutu içinde bölge, hesaplanan değerler FRET edildi. FRET verimliliği sadece yönlendirme amaçlı görüntü birleştirilmiş bir CFP / YFP büyütülmüş bir kaplama düşük (mor-0.0) yüksek mutlak bir aralığı (kırmızı-1.0) olarak görüntülenir.
Discussion
Başarısı için kritik olan birkaç adım vardır. Bunların arasında en belirgin iki kimerik reseptörleri arasında ifade göreli seviyeleri. Bu sorunu aşmak için, bir iki ilgi proteinleri ifade stabil hücre hatları yapmak veya eşdeğer ifade izin vektör DNA en iyi oranlar tespit edebilir. Benzer şekilde, bir yemek boyunca üniform olmayan transfeksiyon nedeniyle, protein düzeyleri nadiren hücreler arasındaki eşdeğer olacaktır. Bu nedenle, dikkat, 'düşük', 'yüksek' expressors ayırt ödenmelidir. Ekran 'ortalama' protein düzeyleri genellikle güvenilir ve tekrarlanabilir sonuç veren bu verimliliğin FRET. Laboratuarımızda bu konuda rahatlatmak için peşine düşmüş bir yöntem ', hatta' gen ekspresyonu adeno ve Lenti-virüs. Ayrıca, alternatif bir yöntem belirlemek için acceptor fotoğraf beyazlatma etkinlikleri sensitize emisyon FRET. Gerçek zamanlı olarak tek hücre izlemek için sensitize emisyon potansiyeline rağmen, biz acceptor fotoğraf beyazlatma daha duyarlı ve daha güvenilir olmak için bulduk rağmen.
Son olarak, protein etkileşimleri izlemek için FRET kullanarak zor ve membran bağlı reseptörleri için linker uzunlukları dikkatli seçimi gerektirir. Ayrıca, C / YFP yanı sıra, sık sık büyük endoplazmik retikulum ve golgi aygıtı agregasyonunda protein ekspresyon düzeyleri ve sonuçları etkiler. Ancak, geçici, ya da dengesiz etkileşimleri, FRET kullanmak için ideal bir yöntem.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr. Scott Henderson konfokal mikroskobu ile yardım için kabul etmek istiyoruz. Bu araştırma, WAB Mikroskopi Tıp Massey Kanser Merkezi ve Okulu (VCU) VCU-Bölümü yapıldı WAB için Ulusal Sağlık 1RO1CA127501 Enstitüleri hibe yanı sıra pilot proje finansmanı tarafından desteklenmiştir. Nörobiyoloji & kısmen NIHNINDS Merkezi çekirdekli hibe 5P30NS047463 finansman ile desteklenen Anatomi Mikroskopi Tesisi,,.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960-069 | |
| Penicillin- Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | N/A | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 11058-021 | |
| FUGENE 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| Coverslip Dishes | MatTek Corp. | P35G014C | |
| pcDNA3.1(+) | Invitrogen | V790‐20 | |
| Mach 1 Competent Cells | Invitrogen | C862003 |
References
- Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
- Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).
