Summary
Обратные генетические подходы оказались чрезвычайно полезными для определения того, какие гены лежащие в основе сопротивления вектора патогенов в комаров. Это видео показывает протокол метод, используемый Джеймсом лаборатории, чтобы придать дсРНК в женские A. aegypti комаров, которые гавани вируса денге. Техника для калибровки инъекции иглами, манипулируя инъекции установки, и потребителей инъекционных дсРНК в грудной клетки показано на рисунке.
Abstract
Обратные генетические подходы оказались чрезвычайно полезными для определения того, какие гены лежащие в основе сопротивления вектора патогенов в комаров. Это видео показывает протокол метод, используемый Джеймсом лаборатории, чтобы придать дсРНК в женские A. aegypti комаров, которые гавани вируса денге. Техника для калибровки инъекции иглами, манипулируя инъекции установки, и потребителей инъекционных дсРНК в грудной клетки показано на рисунке.
Protocol
- Сделать микроинъекции иглы, потянув стеклянные капилляры. Мы используем иглы съемник из СО Инструмент Саттер, (модель P-2000). Иглы спецификации съемник программы являются:
тепла: 275
Фил: 3
Vel: 37
дель: 250
Пул: 125 - Нагрузка известного объема (например, 1 мкл) воды в хвое и вручную знак масштаба с тонкой шулер.
- Настройка после инъекции чашка для комаров. Первое сокращение outmost наконечник офф 1000 мкл кончиком пипетки. Затем вырезать отверстие в сторону чашку и вставить оставшуюся часть пипетки в чашке. Положите чистый или крышки на верхней части чашки.
- Заполните два пенополистирола коробки со льдом. Место ледовой коробке № 1 под стереомикроскопа и место стекла препаратного стекла на льду.
- Обезболить взрослых комаров с CO 2 и место чашки вместе со взрослыми в ледовой коробке # 2.
- Подготовка игла для инъекций дсРНК. Положите иглу заполнены дсРНК на пластиковый шланг инъекций блока (для описания инъекции блока см. ниже).
- Перемещение наркозом комара от чашку часовым стеклом щипцами. Перерыв инъекций иглой на противомоскитные кутикулы. Сбросьте эту комара.
- Для инъекций, игла вводится в грудную клетку от комаров. Свободной рукой, отрегулируйте клапан инжектора от «позе покоя» до «инъекций позицию" и сжатия поршнем до необходимого количества дсРНК были введены.
- Место инъекции комаров в после инъекции чашку.
Инъекция блок создан
- Fix 50 мл шприца шлакоблок.
- Прикрепить регулируемый 1-ходовой клапан до конца шприца, по крайней мере 2 выхода воздуха.
- Присоединить шланг герметичной пластиковой до 1 для выхода воздуха.
- Вставьте микропипетки адаптер в свободный конец шланга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.