ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

Summary

אנו מתארים את הליך להכין מבוים

Abstract

העובר תסיסנית היא מערכת מודל אטרקטיבי עבור חוקרת את בסיס תאית ומולקולרית של התפתחות עצבית. כאן אנו מתארים את הליך להדמיה של מערכת העצבים העוברית תסיסנית באמצעות נוגדנים חלבונים עצביים. מאז כל המערכות עובריים העצבים ההיקפית העצבים המרכזית מאופיינים גם ברמה של תאים בודדים (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. בודמר et al, 1987;. בודמר et al, 1989), כל סטיות למערכות אלו יכולים ניתן לזהות בקלות באמצעות נוגדנים חלבונים עצביים שונים. עוברים לפתח נאספות בזמנים מסוימים על מנת להבטיח כי העוברים נמצאים בשלבי ההתפתחות הנכון להדמיה. לאחר איסוף, שכבות החיצוני של העובר, הקרום סיסית ואת המעטפה vitelline העוטף את העובר, יוסרו לפני קיבעון. עוברים מודגרת אז עם נוגדנים עצב דמיינו באמצעות נוגדנים משני שכותרתו fluorescently. עוברים בשלבים 12-17 הם דמיינו לגשת את מערכת העצבים העוברית. בשלב 12 את הלהקה CNS נבט מתחיל קיצור שלב 15 דפוס סופי של השליכה הושגה. עד שלב 17 CNS החוזים ואת PNS היא מפותחת (קמפוס, אורטגה et al. 1985). לפיכך שינויים בדפוס של PNS ו CNS ניתן להבחין בקלות במהלך השלבים ההתפתחותיים.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים

1. הכן את הצפת PEMFA באמצעות צינורות 100mm, 2mm EGTA, ו 1 mM MgSO _4. התאם את ה-pH של המאגר כדי 7.0. המאגר PEMFA מעוקר לסנן מאוחסנים 4 ° C.
2. הכן PBT ידי הוספת 1ml של טריטון X-100 ל 100 מ"ל 1x PBS (בופר פוספט) (pH 7.0). חנות ב 4 ° C.
3. הכן BSA 5% (שור אלבומין) עם NaAcide 0.01% ב 1x PBS (pH 7.0).
4. הכן את תמיסת מלח באמצעות 0.7% NaCl ו - 0.03% Triton X-100 במים deionized.
5. הכן את מקבע על ידי שילוב של 4 חלקים חיץ PEMFA עם פורמלדהיד 1 חלק 37%.

2. אוסף של עוברים

1. הכינו כלוב עבור המתח תסיסנית הריבית על ידי הצבת> 100 זבובים בבקבוק פלסטיק המכיל מתאם עם צלחת האכלה אגר.
2. השאירו את הכלוב של זבובים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 72 שעות, שינוי לוחות כל 8-12 שעות, כך זבובים יתרגלו הכלוב לא מחזיקים את ביציהם.
3. לצורך הניסוי לאסוף עוברי למשך 12 שעות. הסר את צלחת פטרי מן המיכל ולהחליף אותו. קח את צלחת פטרי להסיר ולשטוף את העוברים מעל המנה בעזרת תמיסת מלח ומברשת צבע נקיים.
4. איסוף עוברים מסננת דקה. לשטוף עם מי מלח כדי להסיר כל עודף שמרים.
5. בעזרת מרית בעדינות להרים את העוברים ולמקם אותם בתוך בקבוק זכוכית קטן עם כובע. הוסף על 1ml של תמיסת מלח.

3. הסרת ממברנות סיסית ו Vitelline ו קיבוע

1. בעקבות האוסף של עוברים, להכין את הפתרון heptane-Fix על ידי שילוב של 50% ו heptane מקבע 50%. הפתרון יהיה שכבתית עם heptane על גבי ואת מקבע על התחתונה.
2. בכל בקבוקון הזכוכית לשטוף את העוברים על ידי דוגרים להם בפתרון מלח במשך 5 דקות. הסר מלוחים עודף באמצעות פיפטה פסטר.
3. שוטפים את העוברים עם מים deionized.
4. Dechorionate את העוברים על ידי דוגרים עליהם אקונומיקה 50% במשך 3 דקות.
5. שוטפים את העוברים ביסודיות במים deionized.
6. תקן את העוברים על ידי דוגרים עליהם במשך 30 דקות בתמיסה heptane-Fix עם רעד עדין.
7. בעזרת פיפטה פסטר להחליף את (השכבה התחתונה) מקבע עם מתנול עוזב את heptane בצינור. Shake במרץ כדי להסיר את הקרום vitelline. עוברים devitellinized ישקעו לתחתית הצינור.
8. אסוף את העוברים בתוך צנצנת זכוכית חדשה באמצעות פיפטה פסטר. שוטפים את העוברים חמש פעמים עם מתנול, בכל פעם לדגור העוברים במשך 5 דקות.

4. מכתים נוגדן, הרכבה, וכן ויזואליזציה

1. רעננותם העוברים בתערובת של פתרון PBT 50% מתנול 50% במשך 5 דקות. ואז רעננותם בפתרון PBT 100% במשך 5 דקות.
2. חסום את העוברים על ידי דוגרים אותם BSA 5% עם פתרון NaAcide 0.01% במשך שעה 1 ב 4 ° C.
3. עוברים מוכנים כעת עבור מכתים נוגדן. הכן את הנוגדן הראשוני על ידי דילול אותו ריכוז המתאימה באמצעות BSA 5% עם פתרון NaAcide 0.01%. אנו משתמשים נוגדן נגד החלבון ציסטאין מחרוזת (CSP), חלבון הסינפטי שלפוחי ו אנטי HRP או סוס peroxidase צנון נוגדנים, אשר מזהה מחצית עצבי ספציפי פחמימות נוכח גליקופרוטאינים על פני השטח כל התוויות נוירונים.
4. דגירה עוברים לילה בשעה 4 ° C בתמיסה הנוגדן הראשוני.
5. למחרת, לשטוף את העוברים 10 פעמים עם PBT במשך שעה.
6. הכן את הפתרון נוגדנים משני על ידי דילול הריכוז המתאים. אנו משתמשים נוגדנים אלקסה משני בריכוז של 1:200.
7. דגירה עוברים במשך שעתיים ב 4 ° C בפתרון נוגדנים משני.
8. שטפו את העוברים 10 פעמים עם PBT במשך שעה.
9. דגירה עוברים לילה Vectashield הרכבה בינונית.
10. הר עוברים בשקופית זכוכית לאטום את תלוש לכסות עם לק. דמיינו עוברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. נציג תוצאות

CSP

HRP-FITC

שמוזגו
איור 1: תמונות נציג מראה את מערכת העצבים המרכזית עובריים בשלב 16-17, באמצעות נוגדנים נגד CSP (אדום) HRP (ירוק). שים לב מכתים נפרדים של השליכה.

CSP

HRP-FITC
"/>
שמוזגו
איור 2: תמונות נציג מראה את PNS עובריים בשלב 16-17 באמצעות נוגדנים נגד CSP (אדום) HRP (ירוק). הערה דפוסי חוזרות ונשנות של הנוירונים ההיקפיים.

Discussion

העובר תסיסנית היא מערכת רבת עוצמה על חקירת השינויים תאית ומולקולרית במהלך ההתפתחות העצבית. בפרוטוקול זה יש לנו הדגימו כיצד להכין עוברים הר שלם אימונוהיסטוכימיה. אנחנו צריכים להתאים את פרוטוקול מן הפרוטוקול המתואר קרול סקוט, 1985. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של נוגדנים צריך להיעשות. יתר על כן, מומים התפתחותיים של PNS ו CNS עובריים ניתן דמיינו בקלות על ידי השוואת עוברים מקווי מוטנטים שונים. השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי להמחיש את PNS ו CNS בעוברים נושאת חלבון מוטנטים המנוע. תחת הגדלה גבוה לנו להעריך גם את הרצועות axonal בתוך PNS ו CNS עובריים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-25
CSP	Developmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITC	Jackson ImmunoResearch	323-095-021
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11004
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000