Summary
Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü tarif
Abstract
Drosophila embriyo sinirsel gelişimi hücresel ve moleküler temelini araştırmak için çekici bir model sistem. Burada nöronal proteinler antikor kullanarak Drosophila Embriyonik sinir sisteminden görünüm için prosedürü açıklar. Tüm embriyonik periferik sinir ve merkezi sinir sistemi, tek tek hücrelerin (; Bodmer ve ark, 1987; Dambly-Chaudiere ve ark, 1986 Bodmer ve ark, 1989) bu yana, bu sistemleri herhangi bir sapmaları farklı nöronal proteinlere karşı antikorlar kullanarak kolayca tanımlanabilir. Gelişmekte olan embriyolar, embriyoların uygun görünüm için gelişim evreleri olduğundan emin olmak için belirli zamanlarda toplanır. Toplandıktan sonra, embriyonun dış katmanları, koryon zarı ve embriyo çevreleyen vitellin zarf, fiksasyon önce kaldırılır. Embriyolar sonra nöronal antikorlar ile inkübe edildi ve floresan etiketli sekonder antikorlar kullanılarak görüntülendi. Aşamada Embriyolar 12-17 Embriyonik sinir sistemine erişmek için görüntülendi. Evre 12 CNS germ bant kısaltılması başlar ve 15 sahne komissür kesin bir model elde edilmiştir. Evre 17 ile MSS sözleşmeleri ve PNS tamamen geliştirilmiştir (Campos-Ortega ve ark, 1985). Böylece PNS ve MSS desen değişiklikleri kolayca bu gelişim evrelerinde görülebilir.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- 100 mM Borular, 2mm EGTA ve 1 mM MgSO 4 PEMFA Tampon kullanarak hazırlayın. Tamponun pH 7.0 'ye ayarlayın. PEMFA tampon filtresi sterilize ve 4 ° C'de saklanan
- 1 ml ekleyerek PBT hazırlayın Triton X-100 100ml 1x PBS (fosfat tamponlu tuz) (pH 7.0). 4 ° C saklayınız
- 1x PBS (pH 7.0)% 0.01 NaAcide ile% 5 BSA (sığır serum albumin) hazırlayın.
- Salin solüsyonu% 0.7 NaCl ve% 0.03 deiyonize su Triton X-100 kullanarak hazırlayın.
- 4 parça PEMFA tampon 1 kısım% 37 formaldehit ile birleştirerek fiksatif hazırlayın.
2. Embriyoların Toplanması
- > 100 sinekler agar besleme plakası ile bir adaptör içeren bir plastik şişe koyarak ilgi Drosophila suşu için bir kafes hazırlayın.
- Sinekler kafes acclimated olsun ve yumurta tutmayın ki, tabak değişen her 8-12 saat, 72 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta sinek kafes bırakın.
- Deney, 12 saat boyunca embriyolar toplamak için. Konteyner Petri kabı çıkarın ve değiştirin. Çıkarılan Petri kabı alın ve yemeğin tuzlu çözüm ve temiz bir boya fırçası kullanarak kapalı embriyolar yıkayın.
- Ince bir elekten embriyolar toplayın. Herhangi bir aşırı maya kaldırmak için tuzlu su ile durulayın.
- Bir spatula ile yavaşça embriyoların pick up ve bir kap ile küçük cam şişe koyun. Yaklaşık 1 ml serum fizyolojik solüsyonu ekleyin.
3. Koryon ve vitellin Membranlar Kaldırma ve Fiksasyon
- Embriyo toplanması ardından,% 50 heptan ve% fiksatif 50 bir araya getirerek Heptan-Fix bir çözüm hazırlayın. Çözüm, üst ve alt kısmında bulunan fiksatif heptan katmanlı olacaktır.
- Cam şişe, 5 dakika boyunca tuzlu bir çözüm onları kuluçka embriyolar yıkayın. Pasteur pipeti kullanarak aşırı tuzlu su çıkarın.
- Embriyolar deiyonize su ile durulayın.
- 3 dakika için% 50 çamaşır kuluçka embriyolar Dechorionate.
- Embriyoların deiyonize su ile iyice durulayın.
- 30 dakika nazik sallayarak Heptan-Fix çözümü için onları kuluçka embriyolar sabitleyin.
- Pasteur pipeti kullanarak, metanol tüp heptan bırakarak sabitleştirici (alt tabaka) değiştirin. Vitellin zar kaldırmak için çalkalanır. Devitellinized embriyoların tüpün dibine batacaktır.
- Pasteur pipeti kullanarak yeni bir cam flakon embriyolar toplayın. Embriyolar metanol ile beş kez çalkalayın, her zaman embriyolar 5 dakika inkübe edin.
4. Antikor Boyama, Montaj ve Görselleştirme
- % 50 PBT çözüm ve 5 dakika boyunca% 50 metanol karışımı embriyolar rehidrate. Sonra 5 dakika boyunca% 100 PBT çözüm rehidrate.
- 4 1 saat süreyle% 0.01 NaAcide çözümü ° C ile% 5 BSA kuluçka embriyolar Blok
- Embriyolar antikor boyama için hazır. % 0.01 NaAcide çözüm ile% 5 BSA kullanarak uygun konsantrasyona seyreltilmesi ile primer antikor hazırlayın. Biz sistein dize protein (CSP), veziküler sinaptik protein ve yüzey glikoprotein ve etiketleri bütün nöronlar bir nöron spesifik karbonhidrat benzer parçaları tanıyan bir anti-HRP veya at turp peroksidaz antikor, karşı bir antikor kullanın.
- 4 geceleme embriyolar inkübe ° C birincil antikor çözümü.
- Ertesi gün, bir saat boyunca PBT embriyoların 10 kez yıkayın.
- Uygun konsantrasyona seyreltilmesi ikincil antikor çözüm hazırlayın. 1:200 bir konsantrasyon Alexa sekonder antikorlar kullanır.
- Iki saat boyunca embriyolar 4 ° C'de ikincil antikor çözümü.
- Bir saat boyunca embriyolar PBT 10 kez yıkayın.
- Vectashield Montaj Orta geceleme embriyolar inkübe edin.
- Bir bardak slayt Mount embriyoların ve oje ile kapak kayma mühür. Bir floresan mikroskop kullanılarak embriyolar görselleştirin.
5. Temsilcisi Sonuçlar
CSP 
HRP-FITC 
Birleştirilmiş
Şekil 1: CSP (kırmızı) ve HRP (yeşil) karşı antikorlar kullanılarak evre 16-17 embriyonik MSS gösteren Temsilcisi görüntüler. Komissür farklı boyama unutmayın.
CSP 
HRP-FITC
"/>
Birleştirilmiş
Şekil 2: CSP (kırmızı) ve HRP (yeşil) karşı antikorlar kullanarak aşamada 16-17 embriyonik PNS gösteren bir temsili görüntüler. Periferik nöron tekrar eden desenler Not.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila embriyo nöronal gelişim sırasında hücresel ve moleküler değişiklikler araştırmak için güçlü bir sistem. Bu protokolde immünohistokimya için bütün montaj embriyoların nasıl hazırlanacağını göstermiştir. Biz bu protokolü Carroll ve Scott, 1985 yılında açıklanan protokol adapte var. Bu protokol aynı zamanda diğer nöronal antikor testi için adapte olabilir, ancak antikorlar optimizasyonu yapılmalıdır. Ayrıca, embriyonik PNS ve merkezi sinir sistemi gelişim kusurları, farklı mutant hatları embriyolar karşılaştırarak kolayca görüntülenebilmekte. Biz başarıyla motor protein mutantlar taşıyan embriyolar PNS ve MSS görselleştirmek için bu protokolü kullandık. Yüksek büyütme altında embriyonik PNS ve merkezi sinir sistemi içinde aksonal parça değerlendirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
