Summary
Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung inszeniert
Abstract
Die Drosophila-Embryo ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen der neuronalen Entwicklung. Hier beschreiben wir das Verfahren für die Visualisierung von Drosophila embryonalen Nervensystems mit Antikörpern gegen neuronale Proteine. Da die gesamte embryonalen peripheren Nervensystems und des zentralen Nervensystems sind gut auf der Ebene der einzelnen Zellen (..; Bodmer et al, 1987;. Dambly-Chaudière et al, 1986 Bodmer et al, 1989) charakterisiert, jede Aberrationen zu diesen Systemen können leicht identifiziert werden mit Antikörpern gegen verschiedene neuronale Proteine. Die Embryonen sind zu bestimmten Zeiten gesammelt, um sicherzustellen, dass die Embryonen in die richtige Entwicklungsstadien für die Visualisierung sind. Nach dem Sammeln werden die äußeren Schichten des Embryos, das Chorion Membran und der Dotter-Umschlag, der den Embryo umgibt, vor der Fixierung entfernt. Die Embryonen werden dann mit neuronalen Antikörpern und visualisiert mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper. Embryos in den Stadien 12-17 visualisiert werden, um die embryonalen Nervensystems zugreifen. Auf Stufe 12 des ZNS Keimstreifs beginnt Verkürzung und von Stufe 15 die endgültige Muster der Kommissur erreicht worden ist. Mit Stufe 17 des ZNS Verträge und die PNS ist voll erschlossen (Campos-Ortega et al. 1985). So Veränderungen in der Struktur des PNS und ZNS können leicht in diesen Entwicklungsstadien beobachtet werden.
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie die PEMFA Buffer mit 100 mM Pipes, 2 mM EGTA und 1 mM MgSO 4. Den pH-Wert des Puffers auf 7,0. Die PEMFA Puffer sterilfiltriert und bei 4 ° C.
- Bereiten PBT, indem 1 ml Triton X-100 bis 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie 5% BSA (Rinderserumalbumin) mit 0,01% NaAcide in 1x PBS (pH 7,0).
- Bereiten Sie die Salzlösung mit 0,7% NaCl und 0,03% Triton X-100 in entionisiertem Wasser.
- Bereiten Sie das Fixativ durch die Kombination von 4 Teilen PEMFA Puffer mit 1 Teil 37% Formaldehyd.
2. Sammlung von Embryos
- Bereiten Sie einen Käfig für die Drosophila-Stamm von Interesse, indem sie> 100 fliegt in einer Kunststoff-Flasche mit einem Adapter mit Agar Fütterung Platte.
- Lassen Sie den Käfig fliegt im Dunkeln bei Raumtemperatur für 72 Stunden, wechselnden Platten alle 8-12 Stunden, so dass die Fliegen, um den Käfig zu bekommen gewöhnt und halten nicht ihre Eier.
- Für das Experiment sammeln Embryonen für 12 Stunden. Entfernen Sie die Petrischale aus dem Behälter und ersetzen Sie sie. Nehmen Sie die Petrischale entfernt und waschen die Embryonen von der Schüssel mit der Kochsalzlösung und einem sauberen Pinsel.
- Sammeln Sie die Embryonen in ein feines Sieb passieren. Spülen mit Kochsalzlösung, um überschüssige Hefe zu entfernen.
- Mit einem Spatel vorsichtig abholen Embryonen und legen Sie sie in eine kleine Glasflasche mit einer Kappe. Fügen Sie zu 1 ml Kochsalzlösung.
3. Die Entfernung des Chorion und Dottergangzyste Membranen und Fixation
- Nach der Sammlung von Embryonen, bereiten Sie die Heptan-Fix-Lösung durch die Kombination von 50% Heptan und 50% Fixativ. Die Lösung wird mit Heptan oben und das Fixativ auf dem Boden geschichtet werden.
- In dem Glasfläschchen waschen die Embryonen durch Inkubation in der Salzlösung für 5 Minuten. Entfernen Sie das überschüssige Salz mit einer Pasteurpipette.
- Spülen Sie die Embryonen mit entionisiertem Wasser.
- Dechorionate die Embryonen durch Inkubation in 50% Bleichmittel für 3 Minuten.
- Spülen Sie den Embryonen gründlich mit entionisiertem Wasser.
- Fix die Embryonen durch Inkubation für 30 Minuten in der Heptan-Fix-Lösung unter leichtem Schütteln.
- Mit einer Pasteurpipette ersetzen die Fixiermittel (unterste Schicht) mit Methanol Verlassen des Heptan in die Röhre. Kräftig schütteln, um die Dotterhaut zu entfernen. Die devitellinized Embryonen wird am Ende der Röhre zu versenken.
- Sammeln Sie die Embryonen in eine neue Glasflasche mit einer Pasteurpipette. Spülen Sie den Embryonen fünfmal mit Methanol, inkubieren jedes Mal die Embryonen für 5 Minuten.
4. Antikörper-Färbung, Montage-und Visualisierungs-
- Rehydrieren die Embryonen in einem Gemisch aus 50% PBT-Lösung und 50% Methanol für 5 Minuten. Dann in 100% PBT-Lösung rehydriert für 5 Minuten.
- Blockieren Sie die Embryonen durch Inkubation in 5% BSA mit 0,01% NaAcide Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C.
- Embryonen sind nun bereit für die Antikörper-Färbung. Bereiten Sie den primären Antikörper durch Verdünnen auf die geeignete Konzentration mit 5% BSA mit 0,01% NaAcide Lösung. Wir verwenden ein Antikörper gegen das Cystein-String-Protein (CSP), eine vesikuläre synaptischen Protein und ein Anti-HRP oder Meerrettichperoxidase-Antikörper, der eine neuronale spezifische-Kohlenhydratanteil in der Oberfläche Glykoproteine und Etiketten aller Neurone erkennt.
- Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht bei 4 ° C in den primären Antikörper-Lösung.
- Am folgenden Tag, waschen Sie die Embryonen 10 Mal mit PBT über den Verlauf einer Stunde.
- Bereiten Sie den sekundären Antikörper-Lösung durch Verdünnung der entsprechenden Konzentration. Wir verwenden Alexa Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1:200.
- Inkubieren Sie die Embryonen für 2 Stunden in 4 ° C in den sekundären Antikörper-Lösung.
- Waschen Sie die Embryonen 10 Mal mit PBT über den Verlauf einer Stunde.
- Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht in Vectashield Eindeckmedium.
- Montieren Sie die Embryonen auf einem Glasträger und Dichtung das Deckglas mit Nagellack. Visualisieren Embryonen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
5. Repräsentative Ergebnisse
CSP 
HRP-FITC 
Zusammengeführt
Abbildung 1: Eine repräsentative Bilder, die die embryonalen ZNS im Stadium 16-17, mit Antikörpern gegen CSP (rot) und HRP (grün). Beachten Sie die unterschiedliche Färbung der Kommissur.
CSP 
HRP-FITC
"/>
Zusammengeführt
Abbildung 2: Eine repräsentative Bilder, die die embryonale PNS bei Stufe 16-17 mit Antikörpern gegen CSP (rot) und HRP (grün). Beachten Sie die sich wiederholenden Mustern von peripheren Neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Drosophila-Embryo ist ein leistungsstarkes System für die Untersuchung der zellulären und molekularen Veränderungen während der neuronalen Entwicklung. In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie man ganze Berg Embryonen für die Immunhistochemie vorzubereiten. Wir haben dieses Protokoll aus dem Protokoll in Carroll und Scott, 1985, beschrieben angepasst. Dieses Protokoll kann auch angepasst werden andere neuronale Antikörper-Test, sondern die Optimierung von Antikörpern getan werden sollte. Darüber hinaus können Entwicklungsstörungen des Embryos PNS und ZNS werden einfach visualisiert durch den Vergleich Embryonen aus verschiedenen Mutanten-Linien. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um die PNS und ZNS in Embryonen mit Motorprotein Mutanten zu visualisieren. Unter starker Vergrößerung haben wir auch die axonale Tracks innerhalb der embryonalen PNS und ZNS ausgewertet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
SG wird durch Mittel aus der State University of New York at Buffalo und von John R. Oishei Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
