Summary
Nós descrevemos o procedimento para preparar encenado
Abstract
O embrião Drosophila é um sistema modelo atraente para investigar as bases celulares e moleculares do desenvolvimento neuronal. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de Drosophila sistema nervoso embrionário utilizando anticorpos para proteínas neuronal. Uma vez que todo o embrião nervoso periférico e sistema nervoso central estão bem caracterizados no nível de células individuais (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), qualquer aberrações para estes sistemas podem ser facilmente identificados através de anticorpos para diferentes proteínas neuronal. Os embriões em desenvolvimento são coletados em determinados momentos para garantir que os embriões estão em fase de desenvolvimento adequado para visualização. Após a coleta, as camadas externas do embrião, a membrana cório eo envelope vitelínico que envolve o embrião, são removidos antes da fixação. Embriões são então incubados com anticorpos neuronal e visualizados usando fluorescente etiquetado anticorpos secundários. Embriões em estágios 12-17 são visualizados para acessar o sistema nervoso embrionário. No estágio 12 a banda germe CNS começa encurtamento e por etapa 15, o padrão definitivo da comissura foi alcançado. Por estágio 17 os contratos do SNC e do SNP está totalmente desenvolvido (Campos-Ortega et al. 1985). Assim, mudanças no padrão do PNS e sistema nervoso central pode ser facilmente observado durante estes estágios de desenvolvimento.
Protocol
1. Preparação dos Reagentes
- Prepare o Buffer PEMFA usando Pipes 100mM, 2mM EGTA, e 1 mM MgSO 4. Ajustar o pH do tampão a 7,0. O buffer PEMFA é esterilizado por filtração e armazenado a 4 ° C.
- Prepare PBT, adicionando 1 ml de Triton X-100 a 100ml 1x PBS (Phosphate Buffered Saline) (pH 7,0). Armazenar a 4 ° C.
- Prepare BSA 5% (albumina bovina) com NaAcide 0,01% em 1x PBS (pH 7,0).
- Prepare a solução salina usando 0,7% de NaCl e 0,03% Triton X-100 em água deionizada.
- Prepare o fixador, combinando quatro partes tampão PEMFA com 1 parte de formaldeído 37%.
2. Coleta de embriões
- Prepare uma gaiola para a cepa Drosophila de interesse, colocando> 100 moscas em uma garrafa de plástico contendo um adaptador de alimentação com placa de agar.
- Deixe a gaiola de moscas no escuro à temperatura ambiente por 72 horas, mudando as placas a cada 8-12 horas, de modo que as moscas se acostumar à gaiola e não mantenha seus ovos.
- Para o experimento coletar embriões para 12 horas. Remova a placa de Petri do recipiente e substituí-lo. Pegue a placa de Petri removido e lavar os embriões fora do prato utilizando a solução salina e um pincel limpo.
- Coletar os embriões em uma peneira fina. Enxaguar com soro fisiológico para remover qualquer excesso de levedura.
- Usando uma espátula delicadamente pegar os embriões e colocá-las num frasco de vidro pequeno com tampa. Adicionar cerca de 1ml de solução salina.
3. Remoção das membranas Chorion e Vitelline e Fixação
- Após a coleta dos embriões, preparar a solução de heptano-Fix, combinando 50% heptano e fixador de 50%. A solução será em camadas com heptano na parte superior eo fixador na parte inferior.
- No frasco de vidro de lavagem dos embriões, incubando-as na solução salina por 5 minutos. Remover salina em excesso com uma pipeta Pasteur.
- Enxágüe os embriões com água deionizada.
- Dechorionate os embriões, incubando-as em água sanitária 50% por 3 minutos.
- Enxágüe os embriões cuidadosamente com água deionizada.
- Fixar os embriões, incubando-as por 30 minutos na solução de heptano-Fix, agitando suavemente.
- Com uma pipeta Pasteur substituir o (camada inferior) fixador com metanol deixando o heptano no tubo. Agite vigorosamente para remover a membrana vitelina. Os embriões devitellinized vai afundar até o fundo do tubo.
- Coletar os embriões em um frasco de vidro novo, utilizando uma pipeta Pasteur. Enxágüe os embriões cinco vezes com metanol, cada vez incubar os embriões por 5 minutos.
4. Coloração de anticorpos, montagem, e Visualização
- Hidratar os embriões em uma mistura de 50% de solução PBT e metanol 50% por 5 minutos. Em seguida, hidratar em 100% PBT solução por 5 minutos.
- Bloco os embriões, incubando-as em BSA 5% com a solução NaAcide 0,01% para 1 hora a 4 ° C.
- Embriões estão agora prontos para a coloração de anticorpos. Prepare o anticorpo primário, diluindo-lo para a concentração adequada usando BSA 5% com a solução NaAcide 0,01%. Nós usamos um anticorpo contra a proteína cadeia cisteína (CSP), uma proteína vesicular sináptica e um anti-anticorpo HRP ou cavalo peroxidase de rabanete, que reconhece uma porção específica de carboidratos neuronal presente no glicoproteínas de superfície e etiquetas todos os neurônios.
- Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C na solução de anticorpo primário.
- No dia seguinte, lave os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora.
- Preparar a solução de anticorpo secundário diluindo a concentração adequada. Usamos anticorpos Alexa secundário na concentração de 1:200.
- Incubar os embriões durante duas horas no 4 ° C na solução de anticorpo secundário.
- Lavar os embriões 10 vezes com PBT ao longo de uma hora.
- Incubar os embriões durante a noite em Vectashield Meio de Montagem.
- Monte os embriões em uma lâmina de vidro e selar a lamínula com unha polonês. Visualize embriões utilizando um microscópio de fluorescência.
5. Resultados representante
CSP 
HRP-FITC 
Fundiram
Figura 1: A Representante imagens mostrando o SNC na fase embrionária 16-17, utilizando anticorpos contra o CSP (vermelho) e HRP (verde). Observe a coloração distinta da comissura.
CSP 
HRP-FITC
"/>
Fundiram
Figura 2: Um representante de imagens mostrando o PNS embrionárias na fase 16-17 usando anticorpos contra o CSP (vermelho) e HRP (verde). Observe a padrões repetidos de neurônios periféricos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O embrião Drosophila é um sistema poderoso para investigar as mudanças celulares e moleculares durante o desenvolvimento neuronal. Neste protocolo temos demonstrado como preparar embriões montar toda a imuno-histoquímica. Nós adaptamos este protocolo a partir do protocolo descrito no Carroll e Scott, 1985. Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser feito. Além disso, defeitos de desenvolvimento do PNS embrionárias e sistema nervoso central pode ser facilmente visualizado através da comparação de embriões a partir de diferentes linhagens mutantes. Temos utilizado com sucesso este protocolo para visualizar o PNS e do SNC em embriões portadores de mutantes da proteína motor. Sob alta ampliação, temos também avaliadas as faixas axonal dentro do PNS embrionárias e CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
- Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
- Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).
