Isolement des cellules souches de l'homme xénogreffes de cancer du pancréas

Summary

Les cellules souches cancéreuses (CSC) ont été identifiées dans un certain nombre de tumeurs malignes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de cytométrie en flux utilisant l'activité aldéhyde déshydrogénase et CD44 et CD24 expression d'isoler les CSC de xénogreffes humaines adénocarcinome pancréatique. Ces cellules viables peuvent ensuite être utilisés dans des études fonctionnelles et analytiques.

Abstract

Les cellules souches cancéreuses (CSC) ont été identifiés dans un nombre croissant de cancers et sont fonctionnellement définis par leur capacité à subir une auto-renouvellement et de produire ^une descendance différenciée. Ces propriétés permettent de récapituler les CSC de la tumeur d'origine lorsqu'il est injecté dans des souris immunodéprimées. CSC au sein d'une tumeur maligne épithéliale ont d'abord été décrite dans le cancer du sein et trouvé d'affichage spécifique l'expression des antigènes de surface des cellules (CD44 ⁺ CD24 ^{faible / -) 2.} Depuis lors, les CSC ont été identifiées dans un nombre croissant d'autres tumeurs malignes humaines CD44 et CD24 à l'aide ainsi que d'un certain nombre d'antigènes de surface autres. Propriétés physiologiques, y compris l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) l'activité, ont également été utilisés pour isoler les CSC à partir des tissus malins ^3-5.

Récemment, nous avons identifié les CSC et les autres à partir adénocarcinome pancréatique basé sur l'activité ALDH et l'expression des antigènes de surface cellulaire CD44 et CD24, CD133 et ^6-8. Ces populations très tumorigènes peuvent ou non se chevaucher et afficher d'autres fonctions. Nous avons constaté que l'ALDH ⁺ et CD44 ⁺ CD24 ⁺ pancréas CSC sont également tumorigène, mais ALDH cellules ⁺ sont relativement plus invasives ^8. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler les CSC du pancréas viables à faible passage de xénogreffes humaines ^9. Tumeurs xénogreffées sont récoltées à partir des souris et faites en une suspension à cellule unique. Débris de tissus et cellules mortes sont séparées de cellules vivantes et colorées à l'aide des anticorps contre CD44 et CD24 et en utilisant le réactif ALDEFLUOR, un substrat fluorescent de l'ALDH ^10. Les CSC sont ensuite isolés par tri cellulaire activé par fluorescence. Isolée CSC peut ensuite être utilisé pour les essais analytiques ou fonctionnelles nécessitant des cellules viables.

Protocol

1. Récolte de xénogreffes Souris

1. Préparer la cellule tampon de dissociation: Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% sérum de veau foetal (FCS), la pénicilline-streptomycine, 200 U / ml de collagénase de type IV, et 0,6 U / ml dispase.
2. Un athymiques (nu + / nu +) abritant un sous-cutanée de souris xénogreffe humaine du cancer du pancréas qui est inférieur à 1 cm de plus grand diamètre est euthanasié par asphyxie de dioxyde de carbone et de dislocation cervicale.
3. La tumeur sous-cutanée est récoltée à partir du flanc de la souris par dissection à l'aide de pinces et de ciseaux et placé immédiatement dans le tampon dissociation cellulaire.
4. Les tumeurs sont pesés et placés de nouveau dans 10 ml de tampon de dissociation cellulaire pour 1 gramme de tissu tumoral.

2. Générer une suspension monocellulaire de la xénogreffes

1. Travailler dans une enceinte de sécurité biologique stérile, la tumeur est transféré à un 100 x 20 mm boîte de culture avec 1 ml de cellules tampon de dissociation. Les tumeurs sont mécaniquement hachée à l'aide de lames de rasoir stérile et une pince. La suspension de cellules tumorales est triturée à travers une pipette de 5 ml sérologiques 10 fois. Les pièces tumeur doit être assez petit pour ne pas obstruer la pipette de 5 ml sérologique.
2. La suspension de cellules tumorales est transféré dans un tube conique de 50 ml contenant le volume restant de la cellule tampon de dissociation (rempli au moins 50%) et vortexés à vitesse maximale pendant 1 minute.
3. La suspension de cellules tumorales est ensuite incubée à 37 ° C pendant 2 heures avec vortex intermittente pendant 1 minute toutes les 20 minutes.

3. Appauvrissent suspension cellulaire de débris tissulaires et des cellules mortes

1. Après l'incubation de 2 heures la suspension cellulaire est vortexé à vitesse maximale pendant 1 minute.
2. La suspension cellulaire est ensuite passée à travers un filtre de 70 um et recueilli dans un endroit frais 50 ml tube conique et ajusté à un volume final de 15 ml par tube.
3. Afin de mieux séparer les cellules viables des cellules mortes et les débris tissulaires, la suspension de cellules tumorales est séparé par centrifugation de densité utilisant Ficoll-Paque Plus. Une sous-couche de Ficoll-Paque Plus est créé par pipetage 15 ml de Ficoll-Paque plus lentement en dessous de la suspension cellulaire en faisant attention de ne pas mélanger les deux couches.
4. La suspension de cellules et les couches sont Ficoll est centrifugé à 500x g pendant 30 minutes avec les freins mis hors tension.
5. Les cellules à l'interface de le Plus Ficoll-Paque et dissociation cellulaire tampon sont recueillies et transférées à une nouvelle de 50 ml tube conique.
6. Frais DMEM supplémenté avec 10% de SVF est ajouté à la suspension de cellules pour le diluer 1:3 (par exemple 20 ml de milieu frais ajoutés à 10 ml de suspension cellulaire).
7. Les cellules sont collectées par centrifugation à 450x g pendant 10 minutes, les médias décanté et le culot cellulaire est resuspendu dans 1 ml de tampon ALDEFLUOR.
8. Dix microlitres de la suspension cellulaire est dilué avec 10 uL bleu trypan et les cellules viables sont comptées en utilisant un hématimètre. Si un grand nombre de cellules mortes ou des débris tissulaires sont notées au cours de cette étape, puis la séparation des cellules par centrifugation de densité peut être répétée (étapes 3.3 à 3.7).

4. Colorer des cellules pour le tri cellulaire activé par fluorescence

1. Étiquette sept 12 x 75 mm tubes en polystyrène de test comme suit:
   1. Sans tache
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. la souris CD31-biotine + souris de lignée biotine + souris H-2Kd-biotine
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + + IgG DEAB _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + souris CD31-biotine + souris de lignée biotine + souris H-2Kd-biotine.
2. Diluer la suspension cellulaire dans 2 mL de tampon ALDEFLUOR à une concentration finale de 5-10 millions de cellules / ml et de garder sur la glace. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules dans des tubes n ° 1, 2, 3 et 4 et les garder sur la glace. Ajouter une DEAB uL dans le tube n ° 6 et de garder sur la glace. Ajouter le réactif ALDEFLUOR à la suspension cellulaire diluée restantes 1000 - pli (par exemple, ajouter 1,6 uL ALDEFLUOR réactif à 1,6 ml de suspension cellulaire), bien mélanger, et placer sur la glace. Transférer 100 ul de ce mélange dans des tubes n ° 5 et 6, et le reste du mélange (1,4 ml) pour le tube n ° 7. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 40 minutes. Mélanger la suspension de cellules toutes les 10 minutes afin d'empêcher les cellules de se fixer au fond des tubes.
3. Centrifuger les cellules à 450x g et 4 ° C pendant 10 minutes et décanter ensuite le tampon. Resuspendre les boulettes dans des tubes # 1 et 5, 100 pi de tampon ALDEFLUOR. Pour les tubes n ° 2, 3, 4 et 6, ajouter 100 ul de tampon ALDEFLUOR contenant les anticorps appropriés dilué comme suit: 1h20 pour les IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, et CD24-PEanticorps; 1:100 pour souris CD31-biotine, la souris de lignée biotine, et la souris H-2Kd-biotine. Dans le tube n ° 7 ajouter 1,4 mL de tampon ALDEFLUOR contenant une dilution 1:20 de CD44-APC, et CD24-PE anticorps et une dilution à 1:100 de souris CD31-biotine, la souris de lignée biotine, et la souris H-2Kd-biotine anticorps. Incuber les suspensions cellulaires sur la glace pendant 10 minutes.
4. Centrifuger les cellules à 450x g et 4 ° C pendant 10 minutes et décanter ensuite le tampon. Resuspendre les boulettes dans des tubes n ° 1, 2, 3, 5 et 6 dans 100 ul de tampon ALDEFLUOR. Préparer 1,5 ml de tampon contenant ALDEFLUOR une dilution à 1:100 de streptavidine-PerCP protéines. Ajouter 100 uL dans le tube n ° 4 et ajouter 1,4 ml au tube n ° 7. Incuber les suspensions cellulaires sur la glace pendant 10 minutes.
5. Centrifuger les cellules à 450x g et 4 ° C pendant 10 minutes et décanter ensuite le tampon. Resuspendre les boulettes dans des tubes n ° 1, 2, 3, 4, 5 et 6 dans 200 ul de tampon ALDEFLUOR. Reprendre le culot dans le tube n ° 7 à 2,8 ml de tampon contenant ALDEFLUOR 2 pg / ml d'iodure de propidium. Garder les tubes sur la glace en tout temps.
6. Passez à travers les cellules de 35 um filtre à l'aide de 12 x 75 mm tubes en polystyrène de test avec des bouchons passoire.

5. Isoler les cellules souches du cancer par le tri cellulaire activé par fluorescence

1. Un cytomètre en flux FACSAria est préparé pour le tri cellulaire.
2. Contrôle de rémunération sont fixés en utilisant des cellules provenant de tubes n ° 1, 2, 3, 4 et 5.
3. Gates sont créés en fonction de l'avant et latérales de dispersion des paramètres à collecter maillots cellule.
4. Non-souris (PerCP-négatif) et viable (teinté d'iodure de propidium non), les cellules sont déclenchées en utilisant le canal FL-3.
5. ALDH cellules ⁺ sont collectés basée sur des portails créés en utilisant DEAB cellules traitées (tube n ° 6) et le FL-1 canal.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ cellules sont collectées basée sur des portails créés en utilisant des cellules colorées par ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, et IgG _2aκ-PE (tube n ° 6) en utilisant le FL-4 et FL-2 canaux.
7. Les cellules sont collectées dans 12 tubes x 75 mm à essai en polystyrène contenant 1 mL de DMEM supplémenté avec 10% de FCS.
8. Après les cellules ont été triées, centrifuger la suspension cellulaire à 450x g pendant 10 minutes, décanter les médias, et remettre en suspension les cellules dans 500 ul DMEM frais complété avec 10% de FCS.
9. Comptez le nombre de cellules triées à l'aide d'un hémocytomètre comme décrit dans l'étape 3.8.

6. Les résultats représentatifs

Ce protocole permettra à l'isolement de l'ALDH ⁺ et CD44 ⁺ CD24 ⁺ pancréas CSC. Le pourcentage de cellules de souris dérivée est variable, mais nous avons constaté que la plupart des humains xénogreffes de cancer du pancréas contiennent 20-60% des cellules de souris dérivées en utilisant la souris CD31, cocktail lignée de souris et la souris H-2Kd biotine conjugué anticorps (figure 1A ). De même la fréquence de chaque population à partir du SCC xénogreffes différents est variable, mais généralement, nous avons constaté que 1-4% de la population cellulaire totale est ALDH ⁺ (figure 1B) et 0,2-5% CD44 ⁺ CD24 est ⁺ (figure 1C).

Nous avons régulièrement compter manuellement les cellules triées à l'aide d'un hémocytomètre depuis le compte machine à FACSAria sont souvent inexactes en raison du non-cellulaire des particules détectées par le FACSAria.

Figure 1. La cytométrie en flux parcelle représentant des populations spécifiques d'une xénogreffe cancer du pancréas. (A) Cellules coloration positive dans le FL-3 canaux (iodure de propidium ^+, CD31 ^{+ +} souris lignée de souris, souris ou H-2Kd ⁺⁾ sont exclus de manière à isoler seulement viables et non des cellules dérivées de souris. (B) l'activité ALDH dans une xénogreffe de cancer pancréatique humain a été mesurée par cytométrie en flux utilisant le réactif ALDEFLUOR en présence et en absence de l'inhibiteur ALDH1 diéthylamino-benzaldéhyde (DEAB). Les cadres représentent portes qui dépeignent les cellules ⁺ ALDH qui ont été créés à partir de cellules traitées avec DEAB puis appliquée à des cellules non traitées. Les pourcentages de cellules ⁺ ALDH sont présentés dans la porte. (C) Le CD44 ⁺ CD24 ⁺ porte a été créé à base de cellules colorées au ALDEFLUOR, et les IgG _2bκ-APC (contrôle isotypique pour le CD44-APC) et des IgG _2aκ-PE (contrôle isotypique pour le CD24-PE) anticorps. Les pourcentages de cellules CD44 ⁺ CD24 ⁺ sont présentés dans la porte.

Discussion

Ce protocole décrit l'isolement de la CSC à partir du pancréas xénogreffes humaines. Plusieurs étapes clés de cette procédure permettra d'améliorer le rendement de la viabilité CSC. Le rétablissement d'une population pure de pancréas CSC est dépendante de la pureté de cellules viables présentes dans la suspension cellulaire avant le tri sur le FACSAria. Prendre soin d'utiliser les xénogreffes qui sont moins de 1 cm de plus grand diamètre permet de réduire la quantité de tissus nécrosés au centre de la tumeur. En outre, les appauvrissant la suspension cellulaire de débris de tissus et cellules mortes pendant la centrifugation de gradient de Ficoll-Paque est critique et peut être répétée si un grand nombre de débris de tissus ou de cellules non viables sont détectés lorsque les cellules sont comptées sur l'hématimètre.

Le protocole de coloration décrit ici utilise le système de réactifs pour détecter l'activité ALDEFLUOR ALDH ainsi que fluorophore conjugué anticorps spécifiques pour détecter les antigènes de surface cellulaire. Coloration ALDEFLUOR est effectuée à 37 ° C et, par conséquent, doit être achevée avant la coloration des anticorps (sur glace) pour éviter les risques de bouchage des anticorps, ce qui peut arriver à 37 ° C. Comme les cellules peuvent efflux le réactif ALDEFLUOR, il est important de maintenir les cellules en ALDEFLUOR tampon à 4 ° C après coloration ALDEFLUOR a été achevé. Le tampon ALDEFLUOR contient un inhibiteur de l'efflux de médicament qui aide à maintenir des niveaux intracellulaires de ALDEFLUOR.

Puisque cette méthode isole du pancréas viables CSC ils peuvent être appliqués dans un certain nombre d'expériences qui mesurent la fonction physiologique de ces cellules. Nous avons utilisé ces cellules pour la tumeur d'initiation dosages utilisant des souris immunodéprimées et in vitro de cellules de migration / invasion des dosages. Par ailleurs, l'ARN, d'ADN et de protéines peuvent être collectées à partir de ces cellules pour des études analytiques en comparant le SCC et la non-CSC populations.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235