בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Summary

סרטן בתאי גזע (CSCs) זוהו במספר מחלות ממאירות. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת תזרים cytometric ניצול אלדהיד דהידרוגנז הפעילות CD44 ו CD24 ביטוי לבודד CSCs מ xenografts אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי. תאים אלה קיימא לאחר מכן ניתן להשתמש במחקרים פונקציונלי אנליטית.

Abstract

סרטן בתאי גזע (CSCs) זוהו מספר הולך וגדל של מחלות ממאירות ומוגדרות תפקודית על ידי היכולת שלהם לעבור התחדשות עצמית לייצר צאצאים הבדיל ^1. מאפיינים אלה מאפשרים CSCs לשחזר את הגידול המקורי כאשר הזריקו לעכברים immunocompromised. CSCs בתוך ממאירות אפיתל תוארו הראשון לסרטן השד ונמצא להציג תאים ספציפיים משטח אנטיגן הביטוי (CD44 ⁺ CD24 ^{/ נמוך -) 2.} מאז, CSCs זוהו מספר הולך וגדל של מחלות ממאירות אדם אחרים באמצעות CD44 ו CD24 וכן מספר אנטיגנים פני אחרים. תכונות פיזיולוגיות, כולל פעילות dehydrogenase (ALDH) אלדהיד, יש גם שימש CSCs לבודד מרקמות ממאיר ^3-5.

לאחרונה, אנו ואחרים זיהו CSCs מ אדנוקרצינומה הלבלב מבוסס על פעילות ALDH ואת הבעת פני השטח אנטיגנים תא CD44 ו CD24, CD133 ו ^6-8. אלה אוכלוסיות tumorigenic מאוד עשוי או עלול לא להיות חופפים להציג פונקציות אחרות. מצאנו כי ALDH ⁺ ו-CD44 ⁺ CD24 ⁺ הלבלב CSCs הם tumorigenic דומה, אבל ALDH תאים ⁺ יחסית יותר פולשנית ^8. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבודד הלבלב CSCs קיימא מן המעבר נמוכה xenografts אדם ^9. גידולים Xenografted נקצרים מעכברים והפך ההשעיה תא בודד. פסולת רקמות תאים מתים מופרדים תאים חיים ומוכתמת מכן באמצעות נוגדנים כנגד CD44 ו CD24 ושימוש מגיב ALDEFLUOR, מצע הניאון של ALDH ^10. CSCs מבודדים מכן על ידי מיון פלואורסצנטי תא הופעל. מבודד CSCs לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחני אנליטית או תפקודית הדורשת תאים קיימא.

Protocol

1. קציר xenografts מעכברים

1. הכן את התא דיסוציאציה חיץ: שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין, סטרפטומיצין, 200 U / mL collagenase סוג ד ', ו 0.6 U / mL dispase.
2. Athymic (נו + / נו +) עכבר מחסה סרטן הלבלב האנושי תת עורית xenograft כי הוא פחות מ 1 ס"מ קוטר הגדול ביותר הוא להרדים בחנק פחמן דו חמצני ו נקע בצוואר הרחם.
3. הגידול תת עורית היא שנקטפו מן האגף של העכבר על ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים והניח מיד למאגר תא דיסוציאציה.
4. גידולים שקל והניח בחזרה לגרם 1 של רקמת הגידול לתוך 10 מ"ל תא דיסוציאציה חיץ.

2. צור השעיה תא בודד מתוך xenografts

1. עבודה סטרילית biosafety הממשלה, הגידול מועבר 100 x 20 מ"מ צלחת עם תרבות מ"ל 1 של חיץ ניתוק התא. גידולים טחון מכנית באמצעות סכיני גילוח סטרילית מלקחיים. המתלים תאים סרטניים הוא triturated דרך pipet 5 מ"ל סרולוגיות 10 פעמים. חתיכות הגידול צריך להיות קטן מספיק כדי לא להדביק את pipet 5 מ"ל סרולוגיות.
2. המתלים תאים סרטניים מועבר צינור 50 מ"ל חרוטי המכיל את נפח הנותרים של התא דיסוציאציה חיץ (מלא פחות מ 50%) vortexed במהירות המרבית למשך דקה 1.
3. המתלים תאים סרטניים הוא מודגרות אז מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם vortexing לסירוגין במשך דקה 1 כל 20 דקות ב 37.

3. לכלות השעיה Cell של פסולת רקמות תאים מתים

1. לאחר דגירה 2 שעות השעיה התא vortexed במהירות המרבית למשך דקה 1.
2. ההשעיה התא לאחר מכן עבר דרך פילטר 70 מיקרומטר ואסף בתוך שפופרת 50 מ"ל טרי חרוטי והותאמו נפח סופי של 15 מ"ל לכל צינור.
3. כדי להמשיך תאים קיימא להפריד תאים מתים ופסולת רקמות, תאים סרטניים ההשעיה היא מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות באמצעות Ficoll-Paque פלוס. Underlayment של Ficoll-Paque Plus נוצר על ידי pipeting 15 מ"ל של Ficoll-Paque פלוס לאט מתחת ההשעיה תא נזהרים שלא לערבב את שתי השכבות.
4. השעיית התא שכבות Ficoll הם הוא centrifuged בשעה 500x גרם במשך 30 דקות עם הבלמים כבוי.
5. תאים על הממשק של Ficoll-Paque פלוס חיץ ניתוק התא נאספים ומועברים שפופרת 50 מ"ל טרי חרוטי.
6. DMEM טריים בתוספת FCS 10% מתווסף ההשעיה תא לדלל אותה 01:03 (למשל 20 מ"ל התקשורת טרי הוסיף 10 מ"ל של השעיה התא).
7. התאים נאספים על ידי צנטריפוגה בשעה 450x גרם במשך 10 דקות, התקשורת יצק, ואת גלולה התא resuspended ב 1 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR.
8. עשרת מיקרוליטר של השעיה התא מדולל עם 10 μL trypan כחול תאים קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. אם מספר גדול של תאים מתים או פסולת רקמות מצוינים במהלך שלב זה, אז ההפרדה התא על ידי צנטריפוגה צפיפות ניתן לחזור (שלבים 3.3-3.7).

4. הכתם תאים עבור מיון פלואורסצנטי תא פעיל

1. Seven לייבל 12 x 75 מ"מ פוליסטירן מבחנות כדלקמן:
   1. בלא כתם
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. עכבר CD31-ביוטין + עכבר השושלת-ביוטין + עכבר H-2Kd-ביוטין
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR DEAB + + IgG _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + עכבר + CD31-ביוטין עכבר השושלת-ביוטין + עכבר H-2Kd-ביוטין.
2. לדלל את ההשעיה תא 2 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR לריכוז סופי של 5-10000000 תאים / מ"ל ​​ולשמור על הקרח. הוספת 100 μL של ההשעיה התא צינורות # 1, 2, 3 ו 4 ולשמור אותם על הקרח. הוסף 1 DEAB μL אל צינור # 6 ולשמור על הקרח. הוסף מגיב ALDEFLUOR על ההשעיה תא הנותרים בדילול 1000 - לקפל (למשל להוסיף 1.6 μL מגיב ALDEFLUOR להשעיית 1.6 תא מ"ל), ומערבבים היטב, ומניחים על קרח. העברת 100 μL של תערובת זו צינורות # 5 ו -6, וכן את התערובת שנותרה (1.4 מ"ל) אל צינור # 7. דגירה של כל הצינורות בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. מערבבים את ההשעיה תא כל 10 דקות כדי למנוע את התאים מן ההתיישבות אל החלק התחתון של הצינורות.
3. צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי צינורות # 1 ו -5 במאגר 100 ALDEFLUOR μL. כדי # 2 צינורות, 3, 4 ו 6, להוסיף 100 μL של חיץ ALDEFLUOR המכיל את הנוגדנים המתאימים בדילול כדלקמן: 1:20 עבור IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, APC-CD44, CD24 ו-PEנוגדנים; 1:100 עבור העכבר CD31-ביוטין, עכבר השושלת, ביוטין, ועכבר H-2Kd-ביוטין נוגדנים. כדי צינור # 7 להוסיף 1.4 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל דילול של 1:20 APC-CD44, CD24 ו-PE נוגדנים דילול 1:100 של העכבר CD31-ביוטין, עכבר השושלת, ביוטין, ועכבר H-2Kd-ביוטין נוגדנים. דגירה השעיות התא על קרח במשך 10 דקות.
4. צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי במבחנות מס '1, 2, 3, 5, 6 במאגר 100 ALDEFLUOR μL. הכן 1.5 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל דילול 1:100 חלבון streptavidin-PerCP. הוספת 100 μL אל צינור # 4 ולהוסיף 1.4 מ"ל על צינור # 7. דגירה השעיות התא על קרח במשך 10 דקות.
5. צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי במבחנות מס '1, 2, 3, 4, 5, 6 במאגר 200 ALDEFLUOR μL. Resuspend גלולה בצינור # 7 ב 2.8 מ"ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​יודיד propidium. שמור צינורות על הקרח בכל עת.
6. מעבר תאים דרך 35 מיקרומטר מסנן באמצעות 12 x 75 מ"מ פוליסטירן מבחנות עם כובעים מסננת.

5. בודד סרטן בתאי גזע על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל

1. Cytometer תזרים FACSAria מוכן מיון התא.
2. שולטת פיצוי נקבעים באמצעות תאים צינורות # 1, 2, 3, 4 ו 5.
3. גייטס נוצרות מבוסס על קדימה ועל תופעות פיזור פרמטרים לאסוף singlets התא.
4. עכבר Non-(PerCP שלילי) ובת קיימא (שאינם propidium מוכתם יודיד) התאים מגודרת באמצעות ערוץ FL-3.
5. ALDH תאים ⁺ נאספים על בסיס השערים שנוצרו באמצעות DEAB שטופלו בתאים (צינור # 6) ואת ערוץ FL-1.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ תאים נאספים על בסיס השערים שנוצרו באמצעות תאים מוכתם ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, ו IgG _2aκ-PE (צינור # 6) באמצעות FL-4 ו FL-2 ערוצים.
7. התאים נאספים 12 x 75 מ"מ פוליסטירן מבחנות המכילות 1 מ"ל של DMEM FCS בתוספת 10%.
8. אחרי תאים מוינו, צנטריפוגה ההשעיה התא 450x גרם במשך 10 דקות, למזוג התקשורת, resuspend התאים 500 DMEM טרי μL בתוספת FCS 10%.
9. ספירת תאים ממוינים באמצעות hemocytometer כמתואר בשלב 3.8.

6. נציג תוצאות

פרוטוקול זה יוביל לבידוד של ALDH ⁺ ו-CD44 ⁺ CD24 ⁺ הלבלב CSCs. אחוז התאים בעכבר הנגזרות משתנה, אך מצאנו כי האדם ביותר סרטן הלבלב xenografts מכילים 20-60% בתאי עכבר הנגזרות באמצעות העכבר CD31, קוקטייל עכבר השושלת, ועכבר H-2Kd ביוטין, מצומדות נוגדנים (איור 1A ). כמו כן התדירות של האוכלוסייה בכל CSC מ xenografts שונים משתנה, אבל בדרך כלל מצאנו כי 1-4% מכלל האוכלוסייה תא הכולל הוא ALDH ⁺ (איור 1B) ו 0.2-5% הוא CD44 ⁺ CD24 ⁺ (תרשים 1C).

אנו שגרתי ידני לספור תאים ממוינים באמצעות hemocytometer מאז מונה FACSAria מכונה לעיתים קרובות לא מדויקים בגלל אי ​​- סלולרי חלקיקים זוהה על ידי FACSAria.

באיור 1. Cytometry העלילה זרימה המתאר אוכלוסיות ספציפיות xenograft בסרטן הלבלב. (א) תאים מכתים חיובי בערוץ-3 FL (propidium יודיד ⁺ עכבר ^{+ +} CD31 עכבר השושלת, או עכבר H-2Kd ⁺⁾ נכללות כדי לבודד רק קיימא ושאינם עכבר נגזר תאים. (ב) פעילות ALDH ב xenograft סרטן הלבלב האנושי נמדד על ידי cytometry זרימה באמצעות ריאגנט ALDEFLUOR בנוכחות והיעדר מעכב ALDH1 diethylamino-benzaldehyde (DEAB). מסגרות מייצגות שערים המתארים תאים ⁺ ALDH שנוצרו על בסיס תאים שטופלו DEAB ולאחר מכן להחיל בתאים שלא טופלו. האחוזים של תאים ALDH ⁺ מוצגים השער. (ג) CD44 ⁺ CD24 ⁺ שער נוצרה על בסיס תאים מוכתם ALDEFLUOR, ואת IgG _2bκ-APC (שליטה isotypic עבור CD44-APC) ו IgG _2aκ-PE (שליטה isotypic עבור CD24-PE) נוגדנים. האחוזים של CD44 ⁺ CD24 ⁺ תאים מוצגים השער.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של הלבלב CSCs מ xenografts האדם. צעדים מרכזיים בהליך זה ישפר את התשואה של CSCs קיימא. ההתאוששות של אוכלוסייה טהורה של הלבלב CSCs תלוי טוהר של תאים קיימא נוכח ההשעיה התא לפני מיון על FACSAria. טיפול להשתמש xenografts כי הם פחות מ -1 ס"מ בקוטר הגדול עוזר להפחית את כמות רקמת נמק במרכז הגידול. בנוסף, ומכלה את ההשעיה תא של פסולת רקמות תאים מתים במהלך צנטריפוגה Ficoll-Paque שיפוע הוא קריטי ניתן לחזור אם מספר גדול של פסולת רקמה או אי - קיימא תאים מזוהים כאשר תאים נספרים על hemocytometer.

פרוטוקול מכתים המתואר כאן מנצל את מערכת מגיב ALDEFLUOR לאתר פעילות ALDH וכן fluorophore-מצומדות הנוגדנים לזהות אנטיגנים ספציפיים פני התא. מכתים ALDEFLUOR מבוצע על 37 מעלות צלזיוס, ולכן צריך להסתיים לפני מכתים נוגדנים (על הקרח) כדי למנוע את הפוטנציאל נוגדן מכסת, אשר יכול לקרות בכל 37 ° C. מאז תאים יכולים בזרימת מגיב ALDEFLUOR, חשוב לשמור על התאים ALDEFLUOR חיץ על 4 מעלות צלזיוס לאחר מכתים ALDEFLUOR הושלמה. המאגר מכיל ALDEFLUOR בזרימת התרופה מעכב המסייע לשמור על רמות תאיים של ALDEFLUOR.

מאז שיטה זו מבודד הלבלב CSCs קיימא הם יכולים להיות מיושמים במספר ניסויים למדוד את הפונקציה הפיזיולוגית של תאים אלה. השתמשנו תאים אלו עבור גידולים ייזום מבחני ניצול עכברים immunocompromised ו במבחנה הגירה / הפלישה מבחני התא. יתר על כן, RNA, DNA, חלבון יכול להיות שנאספו תאים אלה ללימודי אנליטית השוואת CSC ולא CSC אוכלוסיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235