Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

Summary

Células-tronco cancerosas (CSCs) foram identificados em uma série de tumores malignos. Neste protocolo, descrevemos um método de citometria de fluxo utilizando atividade aldeído desidrogenase e CD44 e CD24 expressão para isolar CSCs de xenoenxertos adenocarcinoma pancreático humano. Estas células viáveis ​​podem então ser utilizados em estudos funcionais e analíticos.

Abstract

Células-tronco cancerosas (CSCs) foram identificados em um número crescente de doenças malignas e são funcionalmente definidas por sua habilidade de sofrer auto-renovação e produzir descendentes diferenciados ^1. Essas propriedades permitem que CSCs recapitular o tumor original quando injetadas em ratos imunodeficientes. CSCs dentro de um tumor maligno epitelial foi primeiramente descrito no câncer de mama e está em exibição específico de células a expressão do antígeno de superfície (CD44 ⁺ CD24 ^{/ low -) 2.} Desde então, CSCs foram identificados em um número crescente de outras doenças malignas humanas usando CD44 e CD24, assim como um número de antígenos de superfície. Propriedades fisiológicas, incluindo a atividade de aldeído desidrogenase (ALDH), também têm sido usados ​​para isolar CSCs de tecidos malignos ^3-5.

Recentemente, nós e outros identificados CSCs de adenocarcinoma do pâncreas com base na atividade ALDH ea expressão dos antígenos de superfície celular CD44 e CD24, CD133 e ^6-8. Estas populações altamente tumorigénico podem ou não podem ser sobrepostas e exibir outras funções. Descobrimos que ALDH ⁺ e CD44 ⁺ CD24 ⁺ pâncreas CSCs são igualmente tumorigénico, mas as células ALDH ⁺ são relativamente mais invasivos ^8. Neste protocolo, descrevemos um método para isolar viável pancreático CSCs de passagem de baixa xenoenxertos humanos ^9. Xenografted tumores são colhidos a partir de camundongos e transformado em uma suspensão de uma única célula. Restos de tecido e células mortas são separados a partir de células vivas e, em seguida, coradas utilizando anticorpos contra CD44 e CD24 e usando o reagente ALDEFLUOR, um substrato fluorescente de ALDH ^10. CSCs são então isolados por separação de células de fluorescência ativado. Isolado CSCs pode então ser usado para ensaios analíticos ou funcionais que requerem células viáveis.

Protocol

1. Xenoenxertos colheita de Ratos

1. Prepare a célula de dissociação buffer: Dulbecco modificado Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS), a penicilina-estreptomicina, 200 U / mL de colagenase tipo IV, e 0,6 dispase U / mL.
2. Um atímicos (nu + / nu +) do mouse abrigar um subcutânea xenoenxerto de câncer humano de pâncreas que é menos de 1 cm de maior diâmetro é sacrificados por asfixia de dióxido de carbono e deslocamento cervical.
3. O tumor é colhida subcutâneo do flanco do mouse por dissecção romba usando uma pinça e tesouras e colocado imediatamente no buffer de células dissociação.
4. Tumores são pesados ​​e colocados de volta em 10 mL de células dissociação tampão por 1 grama de tecido do tumor.

2. Gerar uma suspensão de células isoladas da xenoenxertos

1. Trabalhando em um estéril biossegurança gabinete, o tumor é transferido para uma placa de cultura 100 x 20 mm com 1 mL de tampão de células dissociação. Tumores são mecanicamente picada usando lâminas de barbear estéreis e fórceps. A suspensão de células tumorais é triturado através de uma pipeta de 5 mL sorológicos 10 vezes. As peças tumor deve ser pequeno o suficiente para não entupir a pipeta de 5 mL sorológicos.
2. A suspensão de células tumorais é transferido para um tubo cônico de 50 mL contendo o volume restante de células dissociação buffer (cheio menos de 50%) e centrifugadas a uma velocidade máxima por 1 minuto.
3. A suspensão de células tumorais é, então, incubados a 37 ° C por 2 horas com vórtex intermitente por 1 minuto a cada 20 minutos.

3. Destroem suspensão de células de restos de tecido e células mortas

1. Após a incubação de 2 horas da suspensão de células é agitadas na velocidade máxima durante 1 minuto.
2. A suspensão de células é então passado através de um filtro de 70 mm e coletado em um tubo de 50 mL fresco cônica e ajustado para um volume final de 15 mL por tubo.
3. Para separar ainda mais células viáveis ​​a partir de células mortas e restos de tecido, a suspensão de células tumorais é separado por centrifugação de densidade Ficoll-Paque Plus. Um underlayment de Ficoll-Paque Plus é criado por pipetar 15 mL de Ficoll-Paque Plus lentamente abaixo da suspensão de células com cuidado para não misturar as duas camadas.
4. A suspensão de células e camadas de Ficoll estão é centrifugado a 500x g por 30 minutos com os freios desligado.
5. Células na interface de o Plus Ficoll-Paque e buffer de células dissociação são coletados e transferidos para um tubo de 50 mL fresco cônico.
6. Frescos DMEM suplementado com 10% SFB é adicionado à suspensão de células para o diluir 1:3 (por exemplo, 20 mL de mídia fresco adicionado a 10 mL de suspensão de células).
7. As células são coletadas por centrifugação a 450X g por 10 minutos, a mídia decantado, eo pellet celular é ressuspenso em 1 mL de tampão ALDEFLUOR.
8. Dez microlitros da suspensão de células é diluído com 10 mL de tripan azul e células viáveis ​​são contadas usando um hemocitômetro. Se um grande número de células mortas ou restos de tecido são anotados durante esta etapa, a separação das células por centrifugação de densidade podem ser repetidos (passos 3,3-3,7).

4. Células mancha para separação de células de fluorescência Activated

1. Rótulo sete 12 x 75 mm tubos de poliestireno teste da seguinte forma:
   1. Imaculado
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. rato CD31-biotina + mouse linhagem-biotina + mouse H-2Kd-biotina
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + + deab IgG _2bκ-APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + mouse CD31-biotina + mouse linhagem-biotina + mouse H-2Kd-biotina.
2. Diluir a suspensão de células em 2 mL de tampão ALDEFLUOR para uma concentração final de 5-10 milhões de células / mL e manter em gelo. Adicionar 100 mL da suspensão de células de tubos # 1, 2, 3 e 4 e mantê-los no gelo. Adicionar 1 mL para tubo de deab # 6 e manter em gelo. Adicionar reagente ALDEFLUOR à suspensão de células restantes diluídas 1000 - fold (por exemplo, adicionar 1,6 mL de reagente ALDEFLUOR para 1,6 mL suspensão celular), misturar bem e colocar no gelo. Transferir 100 mL dessa mistura para tubos de # 5 e 6, ea mistura restante (1,4 mL) ao tubo n º 7. Incubar todos os tubos em banho-maria a 37 ° C por 40 minutos. Misture a suspensão celular a cada 10 minutos a fim de impedir as células de sedimentação para o fundo dos tubos.
3. Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1 e 5 em cada 100 mL de buffer ALDEFLUOR. Para tubos # 2, 3, 4 e 6, adicionar 100 mL de ALDEFLUOR buffer que contém os anticorpos adequados diluído da seguinte forma: 1:20 para IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, e CD24-PEanticorpos; 1:100 para mouse CD31-biotina, mouse linhagem-biotina e mouse H-2Kd-biotina anticorpos. Ao tubo # 7 adicionar 1,4 mL de tampão contendo ALDEFLUOR uma diluição 1:20 do CD44-APC, e CD24-PE anticorpos e uma diluição de 1:100 do mouse CD31-biotina, mouse linhagem-biotina e mouse H-2Kd-biotina anticorpos. Incubar as suspensões de células no gelo por 10 minutos.
4. Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1, 2, 3, 5, e 6 em 100 mL de buffer ALDEFLUOR. Prepare 1,5 mL de tampão contendo ALDEFLUOR uma diluição de 1:100 de estreptavidina-PerCP proteína. Adicionar 100 mL para o tubo n º 4 e adicionar 1,4 mL para tubo de # 7. Incubar as suspensões de células no gelo por 10 minutos.
5. Centrifugar as células a 450X g e 4 ° C por 10 minutos e decantar o buffer. Volte a suspender as pelotas em tubos de # 1, 2, 3, 4, 5 e 6 em 200 mL de buffer ALDEFLUOR. Ressuspender o sedimento em tubo de 7 em 2,8 mL de tampão contendo 2 ALDEFLUOR mcg / mL de iodeto de propídio. Mantenha os tubos no gelo em todos os momentos.
6. Passe as células através de 35 mícrons filtro com 12 x 75 mm tubos de ensaio com tampas de poliestireno filtro.

5. Isolar células-tronco cancerosas por separação de células de fluorescência Activated

1. Um citômetro de fluxo FACSAria está preparado para separação de células.
2. Controles de compensação são definidas usando as células dos tubos n º 1, 2, 3, 4 e 5.
3. Portões são criados com base em declarações de lado e dispersão de parâmetros para coletar singlets celular.
4. Mouse-sem (PerCP-negativos) e viáveis ​​(não coradas propidium iodeto), as células são fechadas através do canal de FL-3.
5. Células ALDH ⁺ são coletados com base em portas criado usando deab células tratadas (tubo # 6) e do canal-1 FL.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ células são coletadas com base em portas criado usando células coradas com ALDEFLUOR, IgG _2bΚ-APC, e IgG _2aκ-PE (tubo # 6) usando o FL-4 e FL-2 canais.
7. As células são coletadas em 12 x 75 mm tubos de ensaio contendo poliestireno 1 mL de DMEM suplementado com 10% SFB.
8. Depois que as células foram ordenadas, centrifugar a suspensão de células em 450X g por 10 minutos, decantar a mídia, e ressuspender as células em 500 mL DMEM fresco suplementado com 10% SFB.
9. Contar o número de células classificadas utilizando um hemocitômetro como descrito no passo 3.8.

6. Resultados representante

Este protocolo vai levar ao isolamento da ALDH ⁺ e CD44 ⁺ CD24 ⁺ CSCs pancreático. A porcentagem de células derivadas do mouse é variável, mas descobrimos que xenoenxerto de câncer pancreático mais humano contêm 20-60% de células de rato derivados usando o mouse CD31, mouse cocktail linhagem, e mouse H-2Kd biotina anticorpos conjugados (Figura 1A ). Da mesma forma a freqüência de cada população CSC de xenoenxertos diferentes é variável, mas geralmente descobrimos que 1-4% da população total de células é ALDH ⁺ (Figura 1B) e 0,2-5% é CD44 ⁺ CD24 ⁺ (Figura 1C).

Rotineiramente manualmente contagem de células classificados usando um hemocitômetro desde a máquina de contagem de FACSAria são muitas vezes imprecisas devido à não-celular partículas detectadas pelo FACSAria.

Figura 1. Enredo citometria de fluxo retratando populações específicas de um xenoenxerto de câncer pancreático. (A) Células coradas positivamente no canal de FL-3 (propidium iodeto ^+, mouse CD31 ^{+ +} lineage mouse, ou mouse H-2Kd ⁺⁾ são excluídos de forma a isolar apenas viáveis ​​e não do rato células derivadas. (B) ALDH atividade em um xenoenxerto de câncer pancreático humano foi medido por citometria de fluxo usando o reagente ALDEFLUOR na presença e ausência do inibidor ALDH1 dietilamino-benzaldeído (deab). Os quadros representam portões que retratam células ⁺ ALDH que foram criadas com base em células tratadas com deab e depois aplicada a células não tratadas. As porcentagens de células ⁺ ALDH são mostrados no portão. (C) O CD44 ⁺ CD24 ⁺ portão foi criado a partir de células coradas com ALDEFLUOR, eo IgG _2bκ-APC (controle isotípico para CD44-APC) e IgG _2aκ-PE (controle isotípico para CD24-PE) anticorpos. As porcentagens de células CD44 ⁺ CD24 ⁺ são mostrados no portão.

Discussion

Este protocolo descreve o isolamento de pâncreas CSCs de xenoenxertos humanos. Várias etapas fundamentais neste procedimento irá melhorar o rendimento de CSCs viável. A recuperação de uma população pura de pâncreas CSCs depende da pureza de células viáveis ​​presentes na suspensão celular antes de classificar na FACSAria. Tendo o cuidado de usar xenoenxertos que são menos de 1 centímetro de diâmetro maior ajuda a reduzir a quantidade de tecido necrosado no centro do tumor. Além disso, esgotando a suspensão de células de restos de tecido e células mortas durante a centrifugação Ficoll-Paque gradiente é crítico e pode ser repetido se um grande número de restos de tecido ou de células não-viáveis ​​são detectados quando as células são contadas sobre o hemocitômetro.

O protocolo de coloração descrito aqui utiliza o sistema de reagentes para detectar atividade ALDEFLUOR ALDH bem como fluoróforos anticorpos para detectar antígenos de superfície específicos de células. ALDEFLUOR coloração é realizada a 37 ° C e, portanto, precisa ser concluído antes de coloração de anticorpos (no gelo) para evitar a possibilidade de nivelamento de anticorpos, o que pode acontecer a 37 ° C. Como as células podem efluxo o reagente ALDEFLUOR, é importante para manter as células em ALDEFLUOR tampão a 4 ° C após coloração ALDEFLUOR foi concluída. O buffer ALDEFLUOR contém um inibidor de efluxo de drogas que ajuda a manter os níveis intracelulares de ALDEFLUOR.

Uma vez que este método isola viável pancreático CSCs eles podem ser aplicados em uma série de experimentos que medem a função fisiológica dessas células. Nós temos usado essas células de tumor de iniciação ensaios utilizando camundongos imunodeprimidos e em células in vitro de migração / invasão ensaios. Além disso, RNA, DNA e proteínas podem ser coletados a partir dessas células para estudos analíticos comparando CSC e não-CSC populações.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235