Выделение стволовых клеток из прав ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы

Summary

Раковые стволовые клетки (CSC) были выявлены в ряде злокачественных новообразований. В этом протоколе описываются проточной цитометрии метод с использованием альдегид дегидрогеназы деятельности и CD44 и CD24 выражение, чтобы изолировать CSCS от человека ксенотрансплантаты аденокарциномы поджелудочной железы. Эти жизнеспособных клеток может быть использована в функциональном и аналитических исследований.

Abstract

Раковые стволовые клетки (CSC), были выявлены в растущее число злокачественных новообразований и функционально определяется их способностью к самообновлению и производят потомство дифференцированных ^1. Эти свойства позволяют CSCS резюмировать первоначальной опухоли при введении в иммунитетом мышей. CSCS в эпителиальных злокачественных были впервые описаны при раке молочной железы и нашла для отображения определенной ячейке поверхностного антигена выражение (CD44 ⁺ CD24 ^{низкий / -) 2.} С тех пор, CSCS были выявлены во все большем числе других злокачественных опухолей человека использовании CD44 и CD24, а также ряд других поверхностных антигенов. Физиологические свойства, в том числе альдегид дегидрогеназы (ALDH) деятельности, также были использованы для изоляции CSCS от злокачественных тканей ^3-5.

В последнее время мы и другие определили CSCS из поджелудочной железы аденокарцинома на основе ALDH деятельности и выражения поверхностных антигенов CD44 и CD24, CD133 и ^6-8. Эти высоко онкогенными населения может или не может быть перекрытие и отображения других функций. Мы обнаружили, что ALDH ⁺ и CD44 ⁺ CD24 ⁺ поджелудочной CSCS аналогичным онкогенными, но ALDH ⁺ клетки являются относительно более инвазивных ^8. В этом протоколе описывается метод, чтобы изолировать жизнеспособной поджелудочной CSCS с низким уровнем прохождения человека ксенотрансплантаты ^9. Xenografted опухолей собирают от мышей и сделал в одной клеточной суспензии. Мусора тканей и мертвые клетки отделяются от живых клеток, а затем окрашивали антителами против CD44 и CD24 и использование реагента ALDEFLUOR, флуоресцентные субстрат ALDH ^10. CSCS которые затем выделяют флуоресценции активирован сортировки клеток. Изолированные CSCS затем могут быть использованы для целей анализа или функциональных анализов требует жизнеспособных клеток.

Protocol

1. Урожай ксенотрансплантаты от мышей

1. Подготовка клеточной диссоциации буфера: Дульбеко изменение Eagle среды (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), пенициллин-стрептомицина, 200 ЕД / мл коллагеназы типа IV, и 0,6 Ед / мл dispase.
2. Athymic (ню + / ню +) мыши укрывательство подкожной человека ксенотрансплантата раком поджелудочной железы, что составляет менее 1 см в наибольшем диаметре усыпляют углекислым газом удушья и шейки дислокации.
3. Опухоль подкожной собирается с фланга мыши, тупой диссекции использованием щипцы и ножницы и располагаться непосредственно в буферной клеточной диссоциации.
4. Опухоли взвешивали и помещали обратно в 10 мл клеточной диссоциации буфер на 1 грамм ткани опухоли.

2. Создание Одноклеточный Отстранение от ксенотрансплантаты

1. Работа в стерильных биобезопасности кабинет, опухоль переходит к 100 х 20 мм культуры блюдо с 1 мл буфера клеточной диссоциации. Опухоли механически измельченного стерильные лезвия бритвы и пинцета. Суспензии клеток опухоли растирают через 5-мл серологические пипетки в 10 раз. Опухоль части должны быть достаточно маленькими, чтобы не засорять 5-мл серологические пипетки.
2. Опухоль суспензии клеток передается в 50-мл коническую трубку с остальной объем клеточной диссоциации буфер (заполнены менее чем на 50%) и перемешивали при максимальной скорости в течение 1 минуты.
3. Опухоль суспензии клеток, затем инкубировали при 37 ° С в течение 2 часов с прерывистым вортексе в течение 1 минуты каждые 20 минут.

3. Разрушающих клеточную суспензию из тканей мусора и мертвых клеток

1. После 2-часовой инкубации суспензии клеток является встряхивали при максимальной скорости в течение 1 минуты.
2. Клеточной суспензии затем проходит через 70-мкм фильтр и собрали в свежем 50-мл коническую трубку и доводят до конечного объема 15 мл на трубе.
3. Для дальнейшего отдельных жизнеспособных клеток от мертвых клеток и тканей мусора, опухоли клеточной суспензии отделяется плотности центрифугирования использованием Ficoll-Paque Plus. Подстилающего слоя из Ficoll-Paque Plus создан pipeting 15 мл Ficoll-Paque Плюс медленно ниже клеточной суспензии стараясь не смешивать два слоя.
4. Суспензии клеток и Ficoll слои центрифугируют при 500x г в течение 30 минут с тормоза выключены.
5. Клетки на стыке Ficoll-Paque Plus и клеточной диссоциации буфера собраны и переданы в свежем 50-мл коническую трубку.
6. Свежий DMEM с добавлением 10% FCS добавляется к клеточной суспензии для разбавления его 1:3 (например, 20 мл свежего СМИ добавляют к 10 мл клеточной суспензии).
7. Клетки собирали центрифугированием при 450x г в течение 10 минут, СМИ сливают, а осадок клеток ресуспендируют в 1 мл буфера ALDEFLUOR.
8. Десять мкл клеточной суспензии разбавляют 10 мкл трипанового синий и жизнеспособных клеток считаются использованием гемоцитометра. Если большое количество мертвых клеток или тканей мусора отметил во время этого шага, то клетка сепарацию по плотности центрифугирования может быть повторена (шаги 3,3 - 3,7).

4. Пятно Клетки для флуоресценции Активированный сортировки клеток

1. Этикетка семь 12 х 75 мм полистирола пробирки следующим образом:
   1. Незапятнанный
   2. CD44-APC
   3. CD24-PE
   4. мышь CD31-биотин + мышь линии-биотин + мышь H-2Kd-биотин
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + + IgG DEAB _2bκ АПК + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44-CD24 + APC-PE + мышь CD31-биотин + мышь линии-биотин + мышь H-2Kd-биотин.
2. Развести клеточной суспензии в 2 мл буфера ALDEFLUOR до конечной концентрации в 5-10 млн. кл / мл, а держать на льду. Добавить 100 мкл клеточной суспензии в пробирки № 1, 2, 3, 4 и держать их на льду. Добавить 1 мкл DEAB к трубе № 6 и держать на льду. Добавить ALDEFLUOR реагента к остальным клеточной суспензии разбавляют 1000 - складка (например, добавить 1,6 мкл реагента ALDEFLUOR до 1,6 мл клеточной суспензии), хорошо перемешать и поместить на лед. Передача 100 мкл этой смеси в пробирки № 5 и 6, а оставшуюся смесь (1,4 мл) к трубке № 7. Инкубируйте все трубы в 37 ° С на водяной бане 40 минут. Смешайте клеточной суспензии каждые 10 минут, чтобы предотвратить клетки от оседания на дно трубы.
3. Центрифуга клеток 450x г и 4 ° С в течение 10 минут, затем перелить в буфер. Ресуспендируют гранул в пробирках № 1 и 5 в 100 мкл буфера ALDEFLUOR. Для труб № 2, 3, 4 и 6, добавьте 100 мкл буфера, содержащего ALDEFLUOR соответствующих антител разбавленный следующим образом: 1:20 для IgG _2bΚ АПК, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC и CD24-PEантител; 1:100 для мыши CD31-биотин, мыши линии-биотин и мышь H-2Kd-биотин антител. Чтобы трубка № 7 добавить 1,4 мл буфера, содержащего ALDEFLUOR 1:20 разбавление CD44-APC и CD24-PE антитела и 1:100 разбавление мыши CD31-биотин, мыши линии-биотин и мышь H-2Kd-биотин антител. Инкубируйте клеточные суспензии на льду в течение 10 минут.
4. Центрифуга клеток 450x г и 4 ° С в течение 10 минут, затем перелить в буфер. Ресуспендируют гранул в тубах № 1, 2, 3, 5 и 6 в 100 мкл буфера ALDEFLUOR. Подготовка 1,5 мл буфера, содержащего ALDEFLUOR 1:100 разведение стрептавидин-PerCP белка. Добавить 100 мкл в трубку № 4 и добавить 1,4 мл в пробирку № 7. Инкубируйте клеточные суспензии на льду в течение 10 минут.
5. Центрифуга клеток 450x г и 4 ° С в течение 10 минут, затем перелить в буфер. Ресуспендируют гранул в тубах № 1, 2, 3, 4, 5 и 6 в 200 мкл буфера ALDEFLUOR. Ресуспендируют гранул в трубе № 7 в 2,8 мл буфера, содержащего ALDEFLUOR 2 мкг / мл пропидий йодида. Хранить трубы на льду во все времена.
6. Pass клеток через 35-мкм фильтр, используя 12 х 75 мм трубы полистирола тест с колпачками сито.

5. Изолировать стволовые раковые клетки путем флуоресцентной Активированный сортировки клеток

1. Цитометр FACSAria поток готов к сортировки клеток.
2. Компенсация контроля устанавливаются с использованием клеток из труб № 1, 2, 3, 4 и 5.
3. Гейтс создаются на основе передового и бокового разброса параметров ячейки для сбора майки.
4. Номера для мыши (PerCP-отрицательные) и жизнеспособного (не пропидий йодида окрашенных) клетки закрытого использовании FL-3 канала.
5. ALDH ^{+ клеток} собираются на основе ворота созданные с помощью DEAB-обработанных клеток (труба № 6) и FL-1 канал.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ клетки собираются на основе ворота созданы с использованием клеток, окрашенных ALDEFLUOR, IgG _2bΚ АПК и IgG _2aκ-PE (труба № 6) с помощью FL-4 и FL-2 каналов.
7. Клетки собраны в 12 х 75 мм полистирола пробирки с 1 мл DMEM с добавлением 10% FCS.
8. После клетки были отсортированы, центрифуги клеточной суспензии в 450x г в течение 10 минут, сцедить СМИ, и ресуспендирования клеток в 500 мкл свежей DMEM с добавлением 10% FCS.
9. Подсчитайте количество клеток с использованием сортируются гемоцитометра как описано в пункте 3.8.

6. Представитель Результаты

Этот протокол приведет к изоляции ALDH ⁺ и CD44 ⁺ CD24 ⁺ CSCS поджелудочной железы. Процент мыши клеток, полученных является переменной величиной, но мы обнаружили, что большинство человеческих ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы содержат 20-60% мышей клеток, полученных с помощью мыши CD31, мыши линии коктейль, и мышь H-2Kd биотин-конъюгированных антител (рис. 1А ). Также частота каждой группы населения, CSC из разных ксенотрансплантаты является переменной величиной, но в целом мы обнаружили, что 1-4% от общей численности населения ячейка ALDH ⁺ (рис. 1b) и 0,2-5% является CD44 ⁺ CD24 ⁺ (рис. 1в).

Мы регулярно вручную подсчет клеток с использованием сортируются гемоцитометра поскольку рассчитывает FACSAria машины часто неверно из-за непористые частицы обнаружены FACSAria.

Рисунок 1. Участок Проточная цитометрия изображением конкретных групп населения от ксенотрансплантата раком поджелудочной железы. (А) Клетки окрашивания положительно в FL-3 канал (пропидий йодид ^+, CD31 ⁺ мышь мышь линии ^+, или мышь H-2Kd ⁺⁾ исключаются таким образом, чтобы выделить только жизнеспособным и не мышь клеток, полученных из. (B) ALDH деятельности в человеческой ксенотрансплантата раком поджелудочной железы была измерена с помощью проточной цитометрии с использованием реагента ALDEFLUOR в присутствии и в отсутствие ингибитора ALDH1 диэтиламино-бензальдегид (DEAB). Кадры представляют собой ворота, которые изображают ALDH ^{+ клеток,} которые были созданы на основе клеток, обработанных DEAB, а затем применяются с необработанными клетками. Процент клеток ALDH ⁺ приведены в ворота. (C) CD44 ⁺ CD24 ⁺ ворот был создан на основе клеток, окрашенных ALDEFLUOR и IgG _2bκ АПК (изотипического контроля за CD44-APC) и IgG _2aκ-PE (изотипического контроля за CD24-PE) антител. Процент CD44 ⁺ CD24 ⁺ клетки приведены в ворота.

Discussion

Этот протокол описывает выделение панкреатического CSCS от человека ксенотрансплантаты. Несколько ключевых шагов в данной процедуре позволит повысить выход жизнеспособных CSCS. Восстановление чистой популяции поджелудочной CSCS зависит от чистоты жизнеспособных клеток в суспензии клеток до сортировки на FACSAria. Осторожно, чтобы использовать ксенотрансплантаты, которые являются менее чем 1-см в наибольшем диаметре помогает уменьшить количество некротических тканей в центре опухоли. Кроме того, разрушающих клеточную суспензию из мусора ткани и мертвых клеток в процессе Ficoll-Paque градиентное центрифугирование является критическим и может быть повторена, если большое количество мусора ткани или нежизнеспособные клетки обнаруживаются, когда клетки рассчитывали на гемоцитометра.

Окрашивание протокол, описанный здесь используется система ALDEFLUOR реагентов для обнаружения ALDH деятельности, а также флуорофора конъюгированных антител для обнаружения специфических антигенов клеточной поверхности. ALDEFLUOR окрашивание производится при температуре 37 ° C и, следовательно, должна быть завершена до окрашивания антител (на льду), чтобы предотвратить возможность антител укупорки, которая может произойти при температуре 37 ° C. Поскольку клетки могут истечение реагентов ALDEFLUOR, важно для поддержания клеток в ALDEFLUOR буфере при 4 ° С после окрашивания ALDEFLUOR была завершена. Буфера ALDEFLUOR содержит ингибитор наркотиков истечения, что помогает поддерживать внутриклеточные уровни ALDEFLUOR.

Поскольку этот метод изолирует жизнеспособной поджелудочной CSCS они могут быть применены в ряде экспериментов, которые измеряют физиологические функции этих клеток. Мы использовали эти клетки для опухоль начала анализов использования иммунитетом мышей и в пробирке миграции клеток / вторжения анализов. Кроме того, РНК, ДНК и белка может быть собрана из этих клеток для аналитических исследований, сравнивающих CSC и не CSC населения.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235