İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

Summary

Kanser kök hücreleri (CSCS) malignitelerin çok sayıda tespit edilmiştir. Bu protokolde, aldehit dehidrogenaz aktivitesi ve CD44 ve CD24 ifade kullanan bir insan pankreas adenokarsinomu xenografts CSCS yalıtmak için akım sitometri yöntemi açıklar. Bu canlı hücreler, sonra fonksiyonel ve analitik çalışmalar kullanılabilir.

Abstract

Kanser kök hücreleri (CSCS) malignitelerin giderek artan sayıda tespit edilmiştir ve işlevsel yeteneklerini, kendini yenileme tabi ve farklılaşmış ^döl 1 üretmek tarafından belirlenir . Bu özellikler, immün sistemi baskılanmış farelere enjekte edildiğinde CSCS orijinal tümör özetlemek için izin verir. CSCS epitelyal malignite içinde meme kanseri ilk açıklanan ve belirli bir hücre yüzey antijen ifade ^(CD44 + ^{CD24 düşük / -)} görüntülemek ^için 2 . O zamandan beri, CSCS CD44 ve CD24 gibi diğer yüzey antijenlerinin bir dizi kullanarak diğer insan malignitelerin giderek artan sayıda tespit edilmiştir. Fizyolojik özellikleri, aldehit dehidrogenaz (ALDH) aktivite de ^dahil olmak üzere 3-5 malign dokulardan CSCS izole etmek için kullanılır olmuştur.

Son zamanlarda, biz ve diğerleri ALDH aktivite ve hücre yüzeyindeki antijenler CD44 ve CD24 ve CD133 ^6-8 ifadesi dayalı pankreatik adenokarsinoma CSCS belirledi. Bu son derece tümörojenik nüfus ya da örtüşen ve diğer işlevleri görüntülemek olmayabilir. Olduğunu saptadık ALDH ⁺ ve CD44 ⁺ CD24 ⁺ pankreas CSCS benzer tümörojenik, ama nispeten daha invaziv ⁸ ALDH ⁺ hücreler. Bu protokolde, düşük geçiş insan ^xenografts 9 canlı pankreas CSCS izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır . Xenografted tümörler farelerden elde edilen hasat ve tek bir hücre süspansiyonu haline getirilmiştir. Doku artıkları ve ölü hücreleri canlı hücrelerden ayrılmış ve daha sonra, CD44 ve CD24 karşı antikor kullanarak ve ALDEFLUOR ^reaktifi ALDH 10 floresan substrat kullanılarak boyandı. CSCS sonra floresan aktif hücre sıralama tarafından izole edilmiştir. İzole CSCS sonra canlı hücreler gerektiren analitik veya fonksiyonel testleri için kullanılabilir.

Protocol

1. Fare ile Hasat Xenografts

1. Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM)% 10 fetal buzağı serumu (FCS), penisilin-streptomisin, 200 U / ml kollajenaz tip IV ve 0.6 U / ml dispase ile desteklenmiş hücre disosiasyon tampon hazırlayın.
2. Büyük çapı 1 cm den daha az bir subkutan insan pankreas kanseri xenograft barındıran bir atimik (nu + / nu +) fare, karbon dioksit boğulma ve servikal dislokasyon ötenazi.
3. Subkutan bir tümör forseps ve makas kullanılarak künt diseksiyon ile fare kanadını hasat ve hemen hücre disosiasyon tampon yerleştirilir.
4. Tümörler tartılır ve tümör dokusu 1 gram başına 10 ml hücre disosiasyon tampon içine yerleştirilir.

2. Tek hücreli bir Xenografts Süspansiyon oluşturun

1. Steril bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmak, tümör hücre disosiasyon tampon 1 ml ile 100 x 20 mm kültür kaplarına aktarılır. Tümörler mekanik steril Jilet ve forseps kullanılarak kıyılmış. Tümör hücre süspansiyonu, 5 ml serolojik pipetlemeyin ile 10 kez triturated. Tümör adet 5 ml serolojik pipetlemeyin tıkamaz kadar küçük olmalıdır.
2. Tümör hücre süspansiyon hücre disosiasyon tampon kalan hacmi (% 50 daha az dolu) içeren 50 ml konik tüp ve 1 dakika boyunca maksimum hızda transfer vortekslenmiş.
3. Tümör hücre süspansiyonu daha sonra, 37 ° C'de 2 saat boyunca her 20 dakikada bir 1 dakika aralıklı bir vorteks ile inkübe.

3. Hücre Doku Enkaz Süspansiyon ve Ölü Hücreleri İncelten

1. 2 saatlik inkübasyondan sonra hücre süspansiyonu, 1 dakika boyunca maksimum hızda vortekslenmiş.
2. Hücre süspansiyonu daha sonra 70 mikron filtre geçirilir ve yeni bir 50-ml konik tüp içinde toplanan ve nihai bir hacim başına 15 ml tüp şekilde ayarlanabilir.
3. , Ölü hücreler ve doku artıkları daha da ayrı bir canlı hücreler, tümör hücre süspansiyonu Ficoll-Paque Plus kullanarak yoğunluğu santrifüj ayrılır. Ficoll-Paque Plus bir underlayment Ayrıca iki kat karıştırmak için dikkatli olmak hücre süspansiyonu altında yavaş yavaş 15 ml Ficoll-Paque pipeting tarafından oluşturulur.
4. Hücre süspansiyon ve frenler ile 30 dakika Ficoll katmanları 500x g santrifüj kapalıdır.
5. Ficoll Paque Plus ve hücre disosiasyon tampon arayüzü hücreler toplanır ve taze bir 50 mL konik tüp transfer.
6. Taze DMEM% 10 FCS ile desteklenmiş sulandırmak için hücre süspansiyonu eklenir 01:03 (10 ml hücre süspansiyonu eklenir örneğin 20 ml taze medya).
7. 10 dakika, dekante medya 450x g santrifüj hücreleri toplanır ve hücre pelletini ALDEFLUOR tampon 1 mL yeniden süspanse.
8. On mikrolitre hücre süspansiyonu, 10 mcL tripan mavi ve canlı hücreler hemasitometre kullanarak sayılır ile seyreltilir. Bu adım sırasında, ölü hücreler ve doku artıkları çok sayıda not edilir, sonra yoğunluğu santrifüj hücre ayırma (3.7 adımlar 3,3) tekrarlanan olabilir.

4. Floresan Aktif Hücre Sıralama Hücreler Leke

1. Olarak Etiket yedi 12 x 75 mm polistiren test tüpleri aşağıdaki gibidir:
   1. Lekesiz
   2. CD44 APC
   3. CD24-PE
   4. fare CD31-biotin + fare soyun-biotin + fare H-2Kd-biotin
   5. ALDEFLUOR
   6. ALDEFLUOR + DEAB + IgG _2bκ APC + IgG _2aκ-PE
   7. ALDEFLUOR + CD44 APC + CD24-PE + fare CD31-biotin + fare soy biotin + fare H-2Kd-biotin.
2. ALDEFLUOR tampon 2 ml hücre süspansiyonu, 5-10 milyon hücreleri / ml bir final konsantrasyon seyreltilir ve buz üzerinde tutmak. Tüpler # 1, 2, 3, ve 4 hücre süspansiyonu 100 mcL ekleyin ve buz üzerinde saklayın. Tüp # 6 1 mcL DEAB ekleyin ve buz üzerinde tutmak. 1000 seyreltilmiş kalan hücre süspansiyonu ALDEFLUOR reaktif ekle kat (örneğin 1.6 ml hücre süspansiyonu 1.6 mcL ALDEFLUOR reaktif eklemek), iyice karıştırın ve buz üzerinde yer. Tüp # 7 100 tüpler # 5 ve 6 için bu karışımın mcL ve kalan karışımı (1.4 mL) aktarın. Tüm tüpleri 40 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Hücrelerin tüplerin altına yerleşmesini önlemek için hücre süspansiyonu, her 10 dakikada bir karıştırın.
3. Santrifüj 450x g hücreleri ve 4 ° C 10 dakika sonra tampon süzün. # 1 ve 5 100 mcL ALDEFLUOR tampon tüpler pelet yeniden süspanse edin. Tüpler # 2, 3, 4, ve 6 için aşağıdaki gibi seyreltilmiş uygun antikorları içeren ALDEFLUOR tampon 100 mcL ekleyin: IgG _2bΚ-APC, IgG _2aΚ-PE, CD44-APC, ve CD24-PE için 01:20antikorlar için 1:100 fare CD31-biotin, fare soy biotin ve fare H-2Kd-biotin antikorlar. # 7 tüpe 1.4 mL CD44 APC 1:20 seyreltme içeren ALDEFLUOR tampon, ve CD24-PE antikorları ve bir fare 1:100 dilüsyon CD31-biotin, fare soy biotin ve fare H-2Kd-biotin antikorlar. 10 dakika boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonları inkübe edin.
4. Santrifüj 450x g hücreleri ve 4 ° C 10 dakika sonra tampon süzün. Pelet tüpler # 1, 2, 3, 5, ve (6) 100 mcL ALDEFLUOR tampon tekrar ALDEFLUOR tampon 1:100 dilüsyon streptavidin-PerCP protein içeren 1,5 mL hazırlayın. Tüp # 4 100 mcL ekleyin ve tüp # 7 1,4 ml ekleyin. 10 dakika boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonları inkübe edin.
5. Santrifüj 450x g hücreleri ve 4 ° C 10 dakika sonra tampon süzün. Pelet tüpler # 1, 2, 3, 4, 5, ve (6) 200 mcL ALDEFLUOR tampon tekrar # 7, 2 mcg / ml propidium iyodür içeren ALDEFLUOR tampon 2,8 ml tüp pelletini tekrar. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun.
6. 35 mikron filtre ile süzgeç kapaklar 12 x 75 mm polistiren test tüpleri kullanarak hücrelerin iletin.

5. Floresan Aktive Hücre Sıralama Kanser Kök Hücreler Isolate

1. Bir FACSAria akış sitometresinin hücre sıralama için hazırlanmıştır.
2. Tazminat kontrolleri tüpler # 1, 2, 3, 4, ve 5 hücreleri kullanılarak ayarlanır.
3. Gates'in hücre mayoları toplamak için ileri ve yan dağılım parametreleri göre oluşturulur.
4. Sigara fare (PerCP negatif) ve uygulanabilir (non-propidium iyodür boyanmış) hücreleri kullanarak kapılı FL-3 kanal.
5. DEAB-tedavili hücrelerde (tüp # 6) ve FL-1 kanal kullanılarak oluşturulan ALDH ⁺ hücrelerin kapıları üzerinde toplanır.
6. CD44 ⁺ CD24 ⁺ hücrelerin kapıları üzerinde toplanan FL-4 ve FL-2 kanallarını kullanarak ALDEFLUOR _2bΚ APC, IgG ve IgG _2aκ-PE (tüp # 6) ile boyanan hücreler kullanılarak oluşturulur.
7. Hücreler,% 10 FCS ile desteklenmiş DMEM 1 mL içeren 12 x 75 mm polistiren test tüpleri toplanmıştır.
8. Hücreler sıralanmış sonra, süzün 10 dakika, medya 450x g hücre süspansiyonu santrifüj ve 500 mcL taze DMEM hücreleri tekrar süspansiyon% 10 FCS ile desteklenebilir.
9. Adım 3.8 'de açıklandığı gibi hemasitometre kullanarak sıralaması hücrelerinin sayısını.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokol ALDH ⁺ ve CD44 ⁺ CD24 ⁺ pankreas CSCS izolasyonuna yol açacaktır. Fare kökenli hücrelerin yüzdesi değişkendir, ama biz çoğu insan pankreas kanseri xenografts fare fare kullanılarak CD31-kökenli hücreleri, fare soy kokteyl, ve fare, H-2Kd biotin-konjuge antikor (Şekil 1A 20-60% içerdiğini buldular .) Aynı şekilde farklı xenografts her CSC nüfus sıklığı değişken, ancak genel olarak toplam hücre popülasyonunun% 1-4 ALDH ⁺ (Şekil 1B) ve% 0,2-5 CD44 ⁺ CD24 ⁺ (Şekil 1C) olduğunu bulduk.

FACSAria makine sayıları FACSAria tarafından tespit hücresel olmayan parçacıklar nedeniyle sık sık yanlış beri rutin hemasitometre kullanarak elle sıralanmış hücreleri saymak.

Şekil 1. Flow sitometri arsa pankreas kanseri xenograft belirli toplumlarda betimleyen (A) FL-3 kanal olumlu boyanma Hücreler (propidium iyodür ⁺ fare CD31 ⁺ fare soy ⁺ veya fare H-2Kd ⁺⁾ sadece izole olarak dışlanan uygulanabilir ve non-fare hücreleri türetilmiştir. (B) bir insan pankreas kanseri xenograft ALDH faaliyet ALDH1 inhibitörü diethylamino benzaldehit (DEAB) varlığı ve yokluğu ALDEFLUOR reaktifi kullanılarak flow sitometri ile ölçüldü. Kare DEAB ile muamele edilen hücreler alınarak oluşturulan ve daha sonra tedavi edilmezse hücrelere uygulanan ^{ALDH +} hücreleri tasvir kapıları temsil eder . ALDH ⁺ hücre yüzdeleri kapısı gösterilmiştir. (C) CD44 ⁺ CD24 ⁺ kapısı ALDEFLUOR ile boyanan hücreler göre oluşturulur ve IgG _2bκ-APC (CD44 APC için izotipik kontrol) ve IgG _2aκ-PE (CD24-PE için izotipik kontrol) antikorları oldu. CD44 ⁺ CD24 ⁺ hücrelerin yüzdeleri kapısı gösterilmiştir.

Discussion

Bu protokol, insan xenografts pankreas CSCS izolasyonu açıklamaktadır. Bu yordamı bazı önemli adımlar uygulanabilir CSCS verimi artıracaktır. Pankreas CSCS saf bir nüfusun kurtarma FACSAria sıralama önce hücre süspansiyonu bulunan canlı hücrelerin saflık bağlıdır. En büyük çapı 1 cm'den daha az olan xenografts kullanmak bakımı tümör merkezinde nekrotik doku miktarını azaltmaya yardımcı olur. Ayrıca, Ficoll Paque degrade santrifüj sırasında doku artıkları ve ölü hücreleri hücre süspansiyonu tüketen kritik ve doku artıkları veya cansız hücrelerin çok sayıda hücre hemasitometre sayıldığında tespit edilmesi halinde tekrar edilebilir.

Boyama protokol burada ALDH faaliyet yanı sıra fluorofor-konjuge antikorları tespit etmek için belirli bir hücre yüzey antijenleri tespit etmek için ALDEFLUOR reaktif sistemi kullanır nitelendirdi. ALDEFLUOR boyama 37 ° C ve bu nedenle, antikor boyama (buz) 37 gerçekleşebilir antikor sınırını potansiyeli, ° C önlemek için önce tamamlanması gerekmektedir Hücreleri ALDEFLUOR reaktif efflux beri, 4 ALDEFLUOR tampon hücreleri korumak için önemli ° C ALDEFLUOR boyama sonra tamamlanmıştır. ALDEFLUOR tampon ALDEFLUOR içi düzeylerini korumak yardımcı olan bir ilaç dışarı atım inhibitörü içerir.

Bu yöntem uygulanabilir pankreas CSCS izole olduklarından, bu hücrelerin fizyolojik fonksiyonu ölçen deneyler bir dizi uygulanabilir. Biz bu hücreler immün sistemi baskılanmış fareler ve in vitro hücre göç / işgali deneyleri kullanarak tümör başlatılması deneyleri için kullandık. Ayrıca, RNA, DNA ve protein, CSC ve non-CSC popülasyonları karşılaştıran analitik çalışmalar, bu hücrelerin toplanabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal calf serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Collagenase type IV	Invitrogen	17104-019
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818
100 x 20 mm culture dish	BD Biosciences	353003
70-μm filter	BD Biosciences	352350
50-mL conical tube	BD Biosciences	352070
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
ALDEFLUOR reagent system	Stem Cell Technologies	01700
Trypan blue	Invitrogen	15250-061
12 x 75 mm polystyrene test tubes	BD Biosciences	352054
CD44-APC (clone G44-26)	BD Biosciences	559942
CD24-PE (clone ML5)	BD Biosciences	555428
Mouse CD31-biotin	BD Biosciences	553371
Mouse lineage-biotin	Miltenyi Biotec	130-092-613
Mouse H-2Kd-biotin	BD Biosciences	553564
IgG2bκ-APC	BD Biosciences	555745
IgG2aκ-PE	BD Biosciences	555574
Streptavidin-PerCP protein	BD Biosciences	554064
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps	BD Biosciences	352235