Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

استراتيجيات لدراسة شروط مسبقة من العصبية الباردة

Published: September 2, 2010 doi: 10.3791/2192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

Summary

نحن نسعى لتحديد إشارات العصبية المسؤولة عن المناعة شروط مسبقة الباردة باعتبارها وسيلة لتحديد أهداف جديدة لتطوير علاجات لحماية الدماغ قبل ظهور الإصابات. نقدم استراتيجيات العمل التي تتطلب مثل هذه النظم البيولوجية ، بالاضافة الى التلاعب التجريبية القدرات التقنية التي يتم استنساخه للغاية وحساسة.

Abstract

إصابة الجهاز العصبي هو سبب كثرة الأمراض والوفيات الناجمة عن التخدير العام والعمليات الجراحية ذات الصلة التي يمكن تخفيف حدتها من خلال تنمية فعالة وسهلة وآمنة لإدارة العلاجات شروط مسبقة. نحن نسعى لتحديد إشارات العصبية المسؤولة عن المناعة شروط مسبقة الباردة باعتبارها وسيلة لتحديد أهداف جديدة لتطوير علاجات لحماية الدماغ قبل ظهور الإصابات. على مستوى منخفض الموالية للالتهابات مما يشير الوسيط التغييرات على مر الزمن ضرورية لالباردة العصبية شروط مسبقة. يشير هذا يتسق مع المبادئ الأساسية لإنهاض تكييف الفسيولوجية ، والتي تتطلب أن المحفزات مهيج تصل قوته العتبة وقتا كافيا للتكيف مع المحفزات لحماية لتصبح واضحة.

تبعا لذلك ، يشير الى ترسيم المناعي المشاركين في الباردة شروط مسبقة العصبية يتطلب أن النظم البيولوجية والتلاعب التجريبية بالإضافة إلى القدرات التقنية واستنساخه للغاية وحساسة. نهجنا هو استخدام شريحة الحصين الثقافات باعتباره النموذج في المختبر الذي يعكس بشكل وثيق في الجسم الحي مع نظيراتها متعددة متشابك الشبكات العصبية تتأثر macroglia ناضجة وهادئة / الدبقية الصغيرة. هذه الدولة الدبقية أهمية خاصة بالنسبة لالدبقية الصغيرة لأنها هي المصدر الرئيسي للالسيتوكينات ، والتي تعمل في نطاق femtomolar. أيضا ، يمكن الحفاظ على الثقافات شريحة في المختبر لعدة أسابيع ، وهو وقت كاف لإثارة المحفزات تفعيل وتقييم الاستجابات التكيفية. أخيرا ، يمكن التحكم بدقة الظروف البيئية باستخدام شريحة الثقافات بحيث يشير خلوى الباردة شروط مسبقة يمكن قياسه ، تحاكي ، ومنظم لتحليل الجوانب عقدة حرجة. تحليلات خلوى نظام الإشارات تتطلب استخدام تقنيات حساسة وقابلة للتكرار المضاعفة. نستخدم PCR الكمي لTNF - α إلى الشاشة لتنشيط دبقية تليها الكمية في الوقت الحقيقي qPCR فحص مجموعة لتقييم التغيرات خلوى الأنسجة واسعة. هذا الأخير هو الأكثر حساسية وسيلة لقياس متعددة استنساخه نظام إشارات خلوى التغييرات في وقت واحد. وأكد تغييرات هامة مع qPCR المستهدفة ومن ثم الكشف عن البروتين. نحن لتحقيق تغييرات على أساس النسيج باستخدام بروتين خلوى المضاعفة المقايسات تدفق microsphere cytometric Luminex باستخدام التكنولوجيا. يتم تحديد الخلية المحددة الإنتاج المزدوج خلوى مع التسمية المناعية. أخذت معا ، وهذا قد إعداد أنسجة المخ وأسلوب استخدامها ، بالإضافة إلى استراتيجيات التحقيق المقترحة ، ويكون النهج الأمثل لتحديد أهداف محتملة لتطوير علاجات جديدة يمكن أن تحاكي مزايا شروط مسبقة الباردة.

Protocol

تقنيات معقمة وخالية من الجراثيم ذات الأهمية الحاسمة لإعداد وصيانة واستخدام شريحة الثقافات لفترات طويلة. وعلاوة على ذلك ، يستند الأساس المنطقي لاستخدام لدينا شريحة من الثقافات إلا بعد 18 يوما في المختبر على الأدلة التي تشير إلى انتقال متشابك مثير والمثبطة يصبح أكثر نضجا ، والدبقية (الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة) تصبح هادئة ومتسقة مع نظرائهم في فيفو (الشكل 1 ).

1. إعداد وصيانة الثقافات شريحة الحصين

  1. في نفس اليوم من زراعة ، يوازن إدراج معقمة في 1.1 سائط النمو مل يتألف من 50 إيغل مل متوسطة بصل ، 25 مل ايرل محلول الملح المتوازن ، و 23 مل حصان المصل ، و 0.5 مل Glutamax (200 سهم ملم) ، و 0.1 مل جنتاميسين (10 مغ / مل الأسهم) ، 0.4 مل Fungizone (250 ميكروغرام / مل) ، 1.45 مل مد الجلوكوز (45 ٪ ، 42 المجموع ملم).
  2. تبقي ست صينيات جيدا في حاضنة عند 36 درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ والرطوبة 95 ٪.
  3. للعقم القصوى ، ويتم استزراع مثالي في HEPA الإيجابية التي تمت تصفيتها ضغط الغرفة الثقافة مع الهواء النقي أيضا عن طريق قائمة بذاتها فوق البنفسجية مراوح الهواء والضوء التطهير ، وبينما يرتدي معطف المختبر النظيفة والقفازات المعقمة امتدت على مدى أكمام معطف المختبر .
  4. إعداد شريحة في الثقافات مغطى الوجه الدخان BSL - 1 الصفحي أن يشمل جميع المواد اللازمة (أي McIlwain المروحية الأنسجة ، والمتعلقة بإدراج تفلون ، شفرة الحلاقة تشريح ، تشريح الباردة (3-4 درجة مئوية) لوحة ، والأدوات الجراحية ، وتشريح أطباق بتري) باستخدام وايلد (M8) stereomicroscope.
  5. تسمح لوحة التبريد (تشغيل من حمام ماء قريب) لتصل إلى درجة حرارة 3-4 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة بينما في الوقت نفسه الكشف عن المواد تشريح للأشعة فوق البنفسجية لإقامة مزيد من عقم منطقة التشريح والأدوات.
    1. يتم اختباره بشكل دوري غطاء تدفق الصفحي لضمان الأشعة فوق البنفسجية لديه قوة كافية على مستوى الطاولة مع متر فوق البنفسجية على الموجات القصيرة قياس الضوء.
  6. استخدام الفئران الوليدة (P8 - P9 و ~ 23 ز / عصام. أعدمت من الفضلات إلى 10 عند الولادة) تخدير مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100 ٪ في مربع الحيوانات الصغيرة على مقاعد البدلاء العقيم وراء غطاء الدخان وتطهيرها بواسطة غمس في الإيثانول بنسبة 100 ٪ في غضون دخن غطاء محرك السيارة ، حيث يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة.
  7. قطع رأس الجراء في نصف طبق بيتري 100 ملم ووضع الرأس في الشوط الثاني ، وذلك باستخدام طبق الطازجة في الجرو.
  8. تشريح خارج الدماغ ووضعه في النصف السفلي من طبق بيتري 60 ملم تحتوي على 10 مل العقيمة الباردة (3-4 درجة مئوية) Gey في محلول الملح المتوازن مع استكمال مد الجلوكوز إلى 6.5 ملغ / مل (أي 7.5 مل من 45 ٪ د الجلوكوز في زجاجة سعة 500 مل من Gey ل.
  9. تشريح خارج الحصين من كل نصف الكرة ووضعها على قرص لتفلون McIlwain المروحية. انتشار وسائل الإعلام بعيدا عن أنسجة المخ باستخدام ملعقة قزحية أقسام الدماغ لمنع قطع من الانضمام إلى شفرة القطع.
  10. القسم الحصين لمحور عمودي الطويلة باستخدام المروحية McIlwain ، مع سماكة وضعت في القسم 350-400 ميكرون.
  11. يغسل بخفة قطع شرائح طازجة الخروج من وإلى إدراج تفلون النصف العلوي من طبق بيتري 60 ملم تحتوي على البارد (3-4 درجة مئوية) محلول ملح في Gey المتوازن مع 6.5 ملغ / مل مد الجلوكوز باستخدام pipettor مل واحد.
  12. فحص شرائح تحت stereomicroscope لالتلفيف المسنن an سليمة وطبقة الخلايا الهرمية.
  13. المكان برفق على شرائح أكبر an إدراج (ثلاثة في ادخال شرائح و 12 / الجرو) والحفاظ في ظل ظروف طبيعية في حضانة حاضنة تنظيف كل ستة أشهر ومعايرة كل ثلاثة أشهر مع محلل ثاني أكسيد الكربون تحت الحمراء ومقياس الحرارة دقيقة إلى منزلة عشرية واحدة.
  14. تحديث وسائط النمو في أطباق ثقافة كل 3-4 أيام في المختبر باستخدام غطاء BSL - 2 وتقنية معقمة.
  15. بعد 7 أيام في المختبر ، استبدال وسائل الاعلام وسائل الاعلام مع 1.1 مل مصل خالية (SFM) ، ويتألف من 97 Neurobasal مل ، 2 مل B27 ، و 0.5 مل Glutamax (200 ملم) ، و 0.1 مل من حامض الاسكوربيك (0.5 م) ، و 0.68 مل D - الجلوكوز (45 ٪ ، 42 المجموع ملم).

2. قبل شاشة حيوية الثقافات شريحة

  1. قسامة Sytox الخضراء الأسهم (10 ميكرولتر) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. تمييع الأسهم Sytox إلى 500 نيوتن متر تركيز العمل في وسائل الاعلام المصل النمو خالية (أي 10 ميكرولتر في وسائل الإعلام 100 مل). Sytox تخزين وسائل الاعلام في 4 درجات مئوية وتستخدم لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  3. 1.1 مل من مكان Sytox لكل بئر في أطباق ثقافة 6 - جيدا والحارة إلى 36 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ لمدة كافية (أي ، كما يتضح من عدم وجود المكثفات على أطباق الثقافة).
  4. وفي الوقت نفسه ، تسمح لمصباح الأشعة فوق البنفسجية (أي مصدر ضوء الفلورسنت مع مرشح FITC) تعمل بالطاقة عن طريق امدادات الطاقة لضمان استقرار موحدة لشدة الضوء الدافئ إلى درجة الحرارة ما لا يقل عن 20 دقيقة.
  5. ثقافات شريحة مكان (18 يوماق في المختبر) في Sytox وسائل الإعلام لمدة 10 دقيقة ومن ثم العودة إلى SFM للكشف عن الاصابة CA1 لا رجعة فيه طبقة هرمية.
  6. عرض الثقافات على سطح العقيم من مجهر مقلوب ، درست تحت التكبير 5X.
  7. تقبل الثقافات مع الخلايا أقل من 30 Sytox إيجابية في المنطقة CA1.

3. الباردة شروط مسبقة

  1. مكان 1.1 مل من SFM في أطباق ثقافة 6 - جيدا. السماح لوسائل الإعلام تبريد (على سبيل المثال ، 30 درجة مئوية) للتوازن في حاضنة (ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ و 95 ٪ نسبة الرطوبة) على الأقل 20 دقيقة قبل الاستخدام. غياب ثقافة المكثفات على أطباق يشير إلى أن الوقت الكافي للموازنة حدث.
  2. نقل إدراج ثقافة شريحة وسائل الاعلام تبريد (1.1 مل / جيد) علبة يحتفظ بها في 30 درجة مئوية ، واحتضان لمدة 90 دقيقة باستخدام تقنية معقمة في غطاء BSL - 2 الدخان.
  3. مكان الثقافات شريحة مرة أخرى إلى الإدارة المستدامة للغابات طبيعية في ظل ظروف طبيعية الحضانة لمدة 24 ساعة ، مرة أخرى باستخدام تقنية معقمة عبر غطاء BSL - 2 الدخان.

4. Excitotoxic الإصابات

  1. تبدأ شريحة prescreen ثقافة استخدام التجريبي من خلال فضح وسائل الاعلام لمدة 20 دقيقة Sytox.
    1. الحصول على صور مع شرائح شريحة الفردية في الحفاظ على اتجاه مشابهة لتلك المستخدمة لprescreen (صور الخلفية). يتم ذلك عن طريق وضع علامة على اليسار وعلامات اثنين إلى اليمين مع القلم علامة على "10" و "اثنين" الساعة على كل إدراج. تسهل هذه المناورة باستخدام نفس المنطقة من شكل لمصلحة كل ثقافة مجموعة من الصور.
  2. في الوقت نفسه ، بدوره على مصدر مصباح الأشعة فوق البنفسجية (في إطار ينظم امدادات الطاقة) ، واتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا لمدة لا تقل عن 20 دقيقة حتى يتمكنوا الحارة لدرجة الحرارة.
  3. ثم ، معايرة الكاميرا CCD مع معيار fluoroscein.
    1. "مسح" لاتفاقية مكافحة التصحر من خلال تعريض للضوء لمدة 50 دورات ما لم يستخدم كاميرا CCD معايرة تلقائيا. لقد أنشأنا برنامجا لمسح داخل MetaMorph لنا الكاميرا التقط كول تستخدم لتقدير حجم الاصابة.
    2. 10 ميكرولتر من مكان في برنامج تلفزيوني fluoroscein 90 مل (10 العازلة الفوسفات مم ، 150 مم كلوريد الصوديوم في 7.3 درجة الحموضة) ودوامة.
    3. ماصة 10 ميكرولتر من خليط fluoroscein الصعود إلى 100 ميكرومتر عدادة الكريات عميقة.
    4. ضبط كامل كثافة الصورة ل1000/4096.
  4. جمع لوحات خلفية الثقافات شريحة للتحقق من أن شروط مسبقة الباردة لم تتسبب في إلحاق ضرر (أي تجاهل الثقافات مع منطقة ≥ CA1 250 من شدة الفائدة).
  5. تعد الصواني مع وسائل الاعلام NMDA.
    1. تحضير محلول المخزون 10 ملم NMDA في الأسبوع على الأقل.
    2. لإصابة excitotoxic ، لتمييع NMDA 20 50 ميكرومتر في SFM ويوازن لظروف طبيعية حضانة لا يقل عن 20 دقيقة.
  6. باستخدام غطاء BSL - 2 وتقنية معقمة ، يدرج في مكان NMDA وسائل الإعلام لمدة 60 دقيقة في ظل ظروف طبيعية الحضانة.
  7. شطف NMDA الخروج من إدراج بواسطة غمس كل إدراج ثلاث مرات في ثلاثة أطباق منفصلة 60 ملم تحتوي كل منها 10 مل Neurobasal تحسنت إلى 36 درجة مئوية. لا تستخدم أكثر من ثلاثة يدرج لكل مجموعة من ثلاثة أطباق يغسل 60 ملم.
  8. عودة الثقافات لظروف الحضانة العادية.
  9. جمع الصور الاصابة بعد 24 ساعة من التعرض لNMDA.
    1. معايرة الكاميرا مع fluoroscein القياسية كما هو موضح أعلاه.
    2. مكان الثقافات في وسائل الاعلام لمدة 20 دقيقة Sytox.
  10. Quantitate الإصابة :
    1. باستخدام البرمجيات MetaMorph ، رسم الهيئة حول CA1 المنطقة.
    2. قياس كثافة المنطقة المحددة "للإصابة".
    3. نسخ ولصق من الهيئة "الضرر" لصورة "الخلفية".
    4. إدخال القيم من "الخسائر" و "الخلفية" في Excel.
    5. Quantitate "البسط ، الخلفية" للرقابة والثقافات الباردة شروطا مسبقة.
    6. الإحصائية باستخدام برنامج (على سبيل المثال ، SigmaStat) ، تشغيل الاختبارات الإحصائية المناسبة لمقارنة إصابة المجموعة التجريبية (ق) مقابل مجموعة مراقبة ، والتي ينبغي أن تدرج دائما مع كل تشغيل التجريبي.
    7. ملاحظة : إذا كانت مستويات الإصابة منخفضة في الصور بعد اصابة ليوم واحد ، وحمل التدريجي التجربة لثلاثة أيام اثنين. قد يكون ملثمين في حماية الثقافات نظرا لعدم وجود قابلية للإصابة (الشكل 2).
    8. ملاحظة : مسألة "حماية" دفعنا إلى الانتقال إلى مستويات الاصابة وليس قياس نسب لجميع المقارنات (الشكل 3).

5. شارك في العلاجات التطبيقية شروط مسبقة مع الباردة

ميزة هامة للثقافات شريحة هو أن الظروف البيئيةويمكن التحكم بدقة ق. وهذا يعني أن الإشارات من خلوى الباردة شروط مسبقة يمكن قياسه ، تحاكي ، والتضمين لتشريح العقدة الجوانب الحرجة.

  1. ويمكن استخدام المؤتلف (على سبيل المثال ، ناهض) البروتينات وتحييد البروتينات (على سبيل المثال ، أو الأجسام المضادة لمستقبلات للذوبان) وتعدل لتقليد ، على التوالي ، مما يشير خلوى.
  2. بشكل عام ، يتم تشكيل هذه البروتينات وتخزين وaliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام في غضون ستة أشهر كافية لضمان النشاط الحيوي.
  3. هنا ، نحن تصف الاستخدام المثالي لإلغاء الإشارات TNF - α باستخدام مستقبلات TNF ذوبان 1 (sTNFR1).
    1. إعادة sTNFR1 في المصل البقري 0.1 ٪ الزلال في برنامج تلفزيوني على مخزون من 50 ميكروغرام / مل ، قسامة في 20-50 ميكرولتر كميات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. للاستخدام ، وتمييع sTNFR1 إلى 200 نانوغرام / مل في وسائل الإعلام شريحة نمو الثقافات تحسنت إلى 36 درجة مئوية والثقافات في مكان sTNFR1 شريحة وسائل الإعلام لمدة 20 دقيقة قبل شروط مسبقة الباردة.
      1. ملاحظة : للحد من التباين ، فمن الأفضل لتمييع 200 نانوغرام / مل sTNFR1 في حجم كبير من وسائط النمو (أي 1:250 التخفيف من 50 ميكروغرام / مل sTNFR1 الأسهم في 10 مل من وسائط النمو يتطلب 40 ميكرولتر sTNFR1) مقابل مضيفا sTNFR1 مباشرة إلى كل بئر في صحن (4.4 ميكرولتر في وسائل الاعلام مل 1.1).
    3. تمييع sTNFR1 إلى 200 نانوغرام / مل في وسائل الإعلام والمكان 1.1 مل في كل إدراج جيدا. السماح لوسائل الإعلام لكي تتوازن إلى 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل تعريض الثقافات شريحة لشروط مسبقة الباردة لمدة 90 دقيقة كما هو موضح أعلاه.
    4. ثقافات شريحة مكان الظهر في 36 درجة مئوية مع sTNFR1 موجودة في وسائل الإعلام.
    5. 24 ساعة في وقت لاحق ، كشف الثقافات إلى وسائل الإعلام لمدة 20 دقيقة Sytox كما هو موضح سابقا ، وجمع الصور الخلفية للتحقق من أن شروط مسبقة الباردة لم تجرح الثقافات.
  4. Quantitate البيانات على النحو المبين أعلاه.
  5. تحديث وسائل الاعلام مع كل مكونات 3-4 أيام في المختبر.

6. Excitotoxic الإصابات المباشرة والمؤجلة بعد شروط مسبقة الباردة

  1. إصابة فورية مع شروط مسبقة الباردة.
    1. أداء الباردة شروط مسبقة كما هو موضح أعلاه.
      1. بعد الباردة شروط مسبقة ، والعودة إلى احتضان الثقافات العادية لمدة 20 دقيقة.
      2. ثم ، تعرض للإصابة الثقافات 20-50 ميكرومتر NMDA لمدة ساعة.
      3. شطف الثقافات ثلاث مرات كما هو موضح أعلاه ، والعودة إلى الحضانة العادية.
      4. بعد 24 ساعة ، والحصول على صور الضرر كما هو موضح أعلاه.
  2. تأخر آثار شروط مسبقة الباردة.
    1. أداء الباردة شروط مسبقة كما هو موضح أعلاه.
    2. كشف الثقافات الاصابة NMDA بعد 24 ساعة كما هو موضح أعلاه.
    3. الاستمرار في الحصول على صور الاصابة لمدة تصل إلى ثلاثة أيام بعد الأولي الباردة شروط مسبقة لمراقبة الحماية.

7. عزل الحمض النووي الريبي

يتم تحجيم التعبير الجيني وفقا للإجراءات من أجل ثقافة شريحة واحدة.

  1. نقل الثقافات شريحة من وسائل الاعلام والنمو الطبيعي لاحتضان RNAlater مل 3 في 6 - جيدا الأطباق الثقافة لتحقيق الاستقرار في الحمض النووي الريبي. المحل في 4 درجات مئوية لتصل إلى ثلاثة أيام حتى معالجتها على النحو المبين أدناه.
  2. رفع بلطف ثقافة شريحة قبالة إدراج بفرشاة الطلاء غيض غرامة ووضعه في 1 مل من البرد (4 درجات مئوية) في برنامج تلفزيوني مل 1.5 (الدناز ، ريبونوكلياز ، وخالية DNA) أنبوب microcentrifuge.
  3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية العينات وإزالة طاف برنامج تلفزيوني.
  4. عينات في مخزن -80 درجة مئوية.
  5. لعزل الحمض النووي الريبي من ثقافات شريحة (~ 250 نانوغرام / عصام) ، وعينات ذوبان الجليد على الجليد.
  6. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم Qiagen MicroRNeasy عبر الإجراءات التالية التي تم وصفها في مزيد من التفاصيل ومقتبسة من كتيب مايكرو RNeasy (Qiagen).
    1. 350 مكان RLT الاحتياطي ميكرولتر (تحتوي على 10 ميكرولتر β - المركابتويثانول لكل مليلتر) في كل أنبوب microcentrifuge شريحة تحتوي على ثقافة واحدة.
    2. التجانس العينات بواسطة vortexing لمدة 30 ثانية. متمزج الأنسجة ، وإذا لزم الأمر (أي نسيج بيليه بادية) باستخدام مدقة المتاح حتى متجانسة تماما في RLT العازلة.
    3. مكان 350 ميكرولتر من الايثانول 70 ٪ في مزيج lysate وماصة للمزيج.
    4. جناسة نقل إلى عمود الدوران ومكان في أنبوب جمع (ترد على حد سواء عمود الدوران وأنابيب جمع بواسطة Qiagen).
    5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية العينة في سرعة قصوى. الإبقاء على العمود.
    6. غسل عمود الدوران من خلال إضافة 350 ميكرولتر RW1 الاحتياطي زائد الطرد المركزي لمدة 15 ثانية بسرعة قصوى. تجاهل العازلة.
    7. تمييع 10 ميكرولتر من الأسهم أنا الدناز العازلة في 70 ميكرولتر RDD لانتاج 80 اجمالي حجم ميكرولتر. ماصة بلطف لمزج لا الدوامة. إعداد 80 ميكرولتر من الأسهم الدناز المخفف لكل عينة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    8. إضافة 350 ميكرولتر RW1 الاحتياطي لأخذ عينات من الأعمدة وتدور أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية. تجاهل أنبوب جمع.
    9. باستخدام أنبوب المجموعة الجديدة ، إضافة 500 RPE الاحتياطي ميكرولتر لعينة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية وتجاهل العازلة.
    10. مكان 500 ميكرولتر من الايثانول 80 ٪ على عينة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة. تجاهل أنبوب جمع.
    11. الأعمدة الجافة التي تدور الطرد المركزي لمدة 5 دقائق بسرعة قصوى مع قبعات أنبوب مفتوحة ، تجاهل أنابيب جمع ونقل عمود الدوران إلى أنبوب جمع 1.5 مل التي قدمتها المجموعة.
    12. لجمع الحمض النووي الريبي معزولة ، ضع 14 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه في وسط الغشاء تدور العمود. أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة وجمع السائل.
    13. إضافة 2 ميكرولتر من RNasin (مخفف في 1 U / ميكرولتر العازلة في TE) وتخزينها في -80 درجة مئوية. TE العازلة يتكون من 10 مم تريس (تريس aminomethane [hydroxymethyl]) ، 1MM EDTA (ملح الصوديوم ethylenediaminetetraacetic حمض هيدرات) في 8.0 درجة الحموضة.

8. RNA الكمي

  1. ملاحظة : RNasin لا تتداخل مع مقايسة RiboGreen.
  2. تمييع RiboGreen 1:200 العازلة في TE ريبونوكلياز خالية على النحو التالي.
    1. TE (مل) : 1 ؛ Ribogreen (ميكرولتر) : 5 ؛
    2. TE (مل) : 4 ؛ Ribogreen (ميكرولتر) : 20 ؛
    3. TE (مل) : 6 ؛ Ribogreen (ميكرولتر) : 30.
  3. وتعد المعايير الحمض النووي الريبي على النحو التالي.
    1. وتستخدم الخميرة الحمض الريبي النووي النقال كمعيار الحمض النووي الريبي. يتم تخزين الحمض الريبي النووي النقال (-20 درجة مئوية) ك 1 ملغ / مل في TE العازلة.
    2. تمييع 1 ملغ / مل 1:100 الأسهم في الشركة المصرية للاتصالات العازلة ، وذلك باستخدام (الدناز ، ريبونوكلياز ، وخالية DNA) 1.5 مل microcentrifuge أنابيب لإنتاج 1 ميكروغرام / مل معيار العمل.
    3. إعداد المنحنى القياسي مباشرة في 96 - جيدا لوحة فحص الفلورسنت بإضافة العازلة TE مخفف أولا ، ثم إضافة كمية مناسبة من معيار ميكروغرام / مل 1 في المنطقة العازلة TE بالفعل في الآبار لوحة كما هو مبين في الجدول المجاور. جعل مكررة الآبار للحصول على النحو التالي : كل معيار.
      1. المجلد. من الأمراض المنقولة جنسيا. (ميكرولتر) : 100 ، المجلد. من الشركة المصرية للاتصالات (ميكرولتر) : 0 ؛ في الحمض النووي الريبي جيدا (نغ) : 100 ؛
      2. المجلد. من الأمراض المنقولة جنسيا. (ميكرولتر) : 80 ، المجلد. من الشركة المصرية للاتصالات (ميكرولتر) : 20 ؛ في الحمض النووي الريبي جيدا (نغ) : 80 ؛
      3. المجلد. من الأمراض المنقولة جنسيا. (ميكرولتر) : 60 ، المجلد. من الشركة المصرية للاتصالات (ميكرولتر) : 40 ؛ في الحمض النووي الريبي جيدا (نغ) : 60 ؛
      4. المجلد. من الأمراض المنقولة جنسيا. (ميكرولتر) : 40 ، المجلد. من الشركة المصرية للاتصالات (ميكرولتر) : 60 ؛ في الحمض النووي الريبي جيدا (نغ) : 40 ؛
      5. المجلد. من الأمراض المنقولة جنسيا. (ميكرولتر) : 20 ، المجلد. من الشركة المصرية للاتصالات (ميكرولتر) : 80 ؛ في الحمض النووي الريبي جيدا (نغ) : 20 ؛
      6. المجلد. من الأمراض المنقولة جنسيا. (ميكرولتر) : 0 ، المجلد. من الشركة المصرية للاتصالات (ميكرولتر) : 0 ؛ في الحمض النووي الريبي جيدا (نغ) : 0.
  4. مستعدة للمقايسة على النحو التالي.
    1. إضافة 99 ميكرولتر من العازلة TE إلى كل من الآبار عينة من 96 لوحة جيدا. أنجع وسيلة للقيام بذلك هو استخدام pipettor الأقنية.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لآبار العينة التجريبية.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من RiboGreen المخفف لكل به جيدا pipettor الأقنية ومتمزج مع واحد أو اثنين من السكتات الدماغية من pipettor.
    4. قراءة لوحة على قارئ لوحة الفلورسنت في الإثارة 480 نانومتر و 520 نانومتر الانبعاثات.
    5. بناء المنحنى القياسي باستخدام Microsoft Excel مع كثافة مضان معايير قياس الحمض النووي الريبي.
    6. حساب التركيزات في عينات الحمض النووي الريبي باستخدام المعادلة الخطية الناتجة من منحنى المعايير.

9. SYBR الخضراء الكمية PCR

  1. تتم PCR أفضل الإجراءات في منطقة نظيفة محفوظة خصيصا للعمل مع الحمض النووي الريبي (الشكل 4).
    1. تطهير المنطقة وما يتصل بها من معدات مختبر الحمض النووي من التلوث المحتملة والنشاط ريبونوكلياز قبل استخدامه مع الأشعة فوق البنفسجية ، التبييض 10 ٪ أو ريبونوكلياز بعيدا.
    2. ارتداء القفازات في جميع الإجراءات.
    3. ريبونوكلياز استخدام المياه مجانا لجميع الإجراءات المنصوص عليها كما هو الحال مع عدة. لا تستخدم DEPC - (diethylpyrocarbonate) المياه المعالجة.
    4. إغلاق كافة أنابيب PCR المتصلة مباشرة بعد استخدامها لتلوث الهباء تؤخر من الحمض النووي الأجنبية.
  2. تطوير وتوصيف الاشعال مرنا للهدف (ق) من الفائدة. وترد تفاصيل هذه الطرق في أساليب تكميلية لHulse وآخرون ، مجلة العلوم العصبية ، 2008 13.
  3. وينتج [كدنا] من الحمض النووي الريبي مجموع 3-20 نانوغرام عبر النسخ العكسي باستخدام iScript.
    1. يتم تحديد الخيار بدء RNA كمية من المبلغ الإجمالي من الحمض النووي الريبي المتاحة بهدف أداء تحليل RT - PCR على جزء من العينة (أي 10 ٪ -20 ٪ من المجموع).
    2. يتم تخزين الجزء الأكبر المتبقي من الحمض النووي الريبي لتحليل المستقبل.
    3. عدة iScript يستخدم مزيجا من hexamers العشوائية والاشعال بنسبة ضئيلة من DT ، وعكس المنتسخة MMLV تعديل في حجم ما مجموعه 20 ميكرولتر.
    4. عائدات النسخ العكسي لمدة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، والناسخ العكسي هو التشويه والتحريف في وقت لاحق على 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. [كدنا] في تمييع العازلة TE إلى التركيز النهائي للالنسبية 0.4 نانوغرام / ميكرولتر لبدء RNA كميتها.
  4. يستخدم SYBR استراتيجية PCR الخضراء القائم على تضخيم [كدنا].
    1. ويتم رصد تفاعلات PCR في الوقت الحقيقي من خلال رصد SYBR الخضراء التأسيس.
    2. ردود الفعل تحتوي على 50 ميكرولتر MgCl 3 مم 2 ، و 200 ميكرومتر dNTPs ، 15 بمول كل من الاشعال إلى الأمام وعكس ، 1 ميكرومتر فلوريسئين ، 1X SYBR الصبغة الخضراء و 10 ميكرولتر (4 نانوغرام) ثقافة شريحة [كدنا] ، و 1.25 U بوليميريز طق البلاتين في رد فعل بوكل عازلة مكونة من 50 ملم و 10 ملم تريس و 8.3 درجة الحموضة.
    3. يتم تنفيذ PCR باستخدام thermocycler iCycler يمكنها جمع البيانات في الوقت الحقيقي.
    4. تتألف من المعلمات الدراجات تمسخ ثوانى 15 (95 درجة مئوية) ، يليه 30 ثانية تمديد / الصلب (60 درجة مئوية) وكرر 45 مرة.
    5. يتم أخذ القياسات البصرية خلال الخطوة الصلب / الإرشاد وحددت القيم ط باستخدام برنامج نظام iCycler.
    6. [كدنا] وتستخدم لأهداف خلوى المصالح وβ الأكتين إلى بناء المنحنيات القياسية.
      1. يتم تحديد عدد النسخ من الوزن الجزيئي والشامل للبلازميد [كدنا].
      2. هي التي شيدت من المنحنيات القياسية في عدد النسخ / الشامل والمدرجة في كل تجربة.
      3. يتم استخدام القيم ط لكل تمييع [كدنا] لتحديد عدد نسخ منحنى ضد ط.
    7. ونحن مصممون خلوى β أكتين مستويات عدد النسخ للعينات باستخدام المنحنيات القياسية.

10. PCR الكمي لميكروأرس]

مجموعة qPCR الكمية في الوقت الحقيقي الفرز هي وسيلة حساسة للغاية وقابلة للتكرار للتحقيق على مستوى منخفض للالتهابات التغييرات التعبير الوسيط.

  1. يتم استخدام مجموعة من RT2 PCR التعريف SABiosciences للالتهابات التغييرات الوسيط التعبير الجيني ، مع الخطوات التالية الموضحة في مزيد من التفاصيل من قبل الشركة المصنعة.
  2. ويستخدم فحص الحمض النووي الريبي ميكروغرام 0،1-1،0. نستخدم شريحة المناطق المحلية (على سبيل المثال ، CA1 الذي يوفر تقريبا 250 نانوغرام الحمض النووي الريبي مجموع اثنين من العينات المجمعة) واحدة أو شرائح بأكملها التي تحتوي على كمية من الحمض النووي الريبي مماثل الإجمالي.
  3. وكتب عكس العينة والسيطرة الرناوات [كدنا] لاستخدام عدة حبلا الأول (على سبيل المثال ، # C - 03).
    1. خلط [كدنا] الناتجة مع مزيج PCR SYBR الخضراء القائم على (# PA - 011) و 25 ميكرولتر aliquotted في كل من الآبار (96) من لوحة مجموعة PCR (قياس 84 الجينات والمورثات تجريبي فريد التدبير المنزلي 16).
    2. مستعدة لوحة واحدة لمجموعة العينة التجريبية ، وهي مستعدة لوحة ثانية للسيطرة.
    3. ملاحظة : سيد الأخضر SYBR مزيج المقدمة من قبل الشركة المصنعة هو الحرارية cycler محددة.
  4. ويتم ذلك باستخدام الدراجات الحرارية iCycler مع بروتوكول دورة تتكون من 40 خطوة تمسخ من 15 ثانية الى 95 درجة مئوية تليها خطوة واحدة تمديد دقيقة عند 60 درجة مئوية. يتم جمع البيانات البصرية خلال خطوة التمديد. ويتبع الدراجات الحرارية عن طريق تحليل مسح منحنى تذوب في درجة الحرارة 55-95 درجة مئوية وتتراوح الزيادات 0.5 ° C.
  5. تم تحديد التعبير النسبية للجينات في لوحات التحكم والمعالجة باستخدام 2 -- الأسلوب ΔΔCt باستخدام برنامج اكسل وتوفير أساس يعبر عنه زيادة أو نقصان أضعاف بالمقارنة مع الضوابط.
  6. وتعتبر الجينات مع شقين الزيادة أو النقصان في التعبير عن مزيد من التقييم.
  7. الجينات التي تم تحديدها من فحص PCR مجموعة (على سبيل المثال ، باستخدام # - 011A بارن لشروط مسبقة الباردة) وكذلك confirmeد qPCR به.
    1. صفائف PCR تحديد الجينات التي تنظم استجابة للمؤثرات.
    2. في المثال من شروط مسبقة الباردة ، حددنا الجينة IL - 11 كما ينظم بشكل إيجابي في الاستجابة لشروط مسبقة الباردة.
    3. الخطوة التالية في التحليل هو لتأكيد أن ينظم الجينات التي تم تشخيصها حديثا في الثقافات شريحة باستخدام مقايسة qPCR المفصلة أعلاه.

11. المضاعفة Microsphere تدفق الفحص البروتين Cytometric

  1. كشف الثقافات شريحة لشروط مسبقة الباردة كما هو موضح أعلاه.
  2. حصاد الثقافات شريحة لفحص البروتين الكلي.
    1. رفع بلطف شرائح قبالة إدراج باستخدام فرشاة غرامة الطرف ومكان بارد في مل 1 (4 درجات مئوية) في برنامج تلفزيوني.
    2. أنابيب الطرد المركزي وإزالة PBS قبالة شريحة الثقافات. مكان على الثلج الجاف حتى انتهاء الحصاد.
    3. أنابيب تخزين في -80 درجة مئوية.
  3. التجانس عينات ثقافة شريحة لإجراء فحص البروتين الكلي.
    1. تعد الخلية العازلة للتحلل التجانس.
      1. باتباع إرشادات الشركة المصنعة (بيو راد) ، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إلى 5 مل من تحلل العازلة ويوضع جانبا على الجليد.
    2. مكان قطع 100 ميكرولتر من تحلل العازلة على الثقافات شريحة وتستنهض الهمم من قبل شرائح pipetting صعودا وهبوطا خمس مرات مع تلميح 100 ميكرولتر ماصة مفتوحة الى 1 ملم.
    3. هزة عينات شاكر على لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة العينات لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    5. طاف لنقل أنبوب نظيفة ويوضع جانبا على الجليد.
  4. إجراء فحص البروتين الكلي.
    1. إعداد جيش صرب البوسنة (ألبومين المصل البقري) المعايير البروتين.
      1. إعادة BSA الأسهم مع الماء عالى النقاء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      2. إعداد معايير البروتين تتراوح بين 0000-1000 ميكروغرام / مل ، مخففة في تحلل العازلة.
    2. حساب حجم كاشف العمل اللازمة وفقا لتعليمات الطقم.
      1. على سبيل المثال ، (ثمانية معايير + 18 عينات غير معروفة) × (اثنان متماثلة) × (200 ميكرولتر كاشف العمل المطلوبة لكل عينة) = 10.4 مل من إجمالي حجم العمل المطلوب لكاشف تحميل الصعود إلى 96 microplate جيدا (على سبيل المثال ، microsphere مقايسة تدفق cytometric ، أنظر أدناه).
      2. عندما خلط الكاشف A B مع الكاشف ، قد تحدث بعض التعكر ، ولكن ينبغي أن تختفي قريبا.
    3. تحميل 10 ميكرولتر من المعايير وعلى عينات microplate.
    4. تحميل 0.2 مل من كاشف العمل في الآبار.
    5. تغطية microplate مع الشريط ختم شاكر ويهز على لوحة لمدة 30 ثانية.
    6. احتضان microplate عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. microplate بارد لدرجة حرارة الغرفة (حوالي 10 دقيقة) قبل القراءة على قارئ لوحة في الطول الموجي 595 نانومتر.
    8. بناء المنحنى القياسي باستخدام Microsoft Excel مع معايير قياس absorbances جيش صرب البوسنة.
    9. حساب تركيزات البروتين في عينات باستخدام المعادلة الخطية الناتجة من منحنى المعايير.
      1. تمييع جميع العينات إلى أدنى تركيز يقاس مع العازلة تحلل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  5. أداء المفرد والمتعدد النسيج نوع plex خلوى (أو السوائل) المقايسات على النحو المبين بالتفصيل في المراجع كاملة # 12 و 16.

12. المناعية

  1. الإصلاح الثقافات لمدة 24 ساعة مع تثبيتي PLP بارافورمالدهيد تتألف من 10 مل 16 ٪ ، 1.096 غرام يسين ، 0.42 غ فوسفات الصوديوم ، والصوديوم بريودات 0.17 غرام ، شغل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 80 مل من الماء عالى النقاء (6.2 درجة الحموضة وتثبيتي).
    1. نجد أن حزب العمال التقدمي هو مثبت مثبت اللطيف الذي يسمح الكشف عن المستوى المنخفض الذي immunostaining خلاف ذلك لن يكون واضحا باستخدام مثبتات أخرى.
    2. يتم إصلاح الثقافات لمدة 24 ساعة ثم نقل مع فرشاة دقيقة لأزيد الصوديوم التي تحتوي على برنامج تلفزيوني (100 ملغم / لتر).
  2. ويتم إنجاز مشرق immunostaining ميدان العائمة الثقافات شريحة كاملة على النحو التالي مع جميع الخطوات بالإضافة إلى اهتزاز في الدقيقة 50 ~.
    1. تغسل شريحة الثقافات في 3 مرات مل three PBS لمدة 10 دقيقة.
    2. إخماد الثقافات في شريحة 0.3 ٪ H 2 O 2.
      1. المخفف 30 ٪ H 2 O 2 في حل الأسهم برنامج تلفزيوني.
    3. تغسل شريحة الثقافات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 دقيقة لكل منهما.
    4. كتلة الثقافات شريحة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في حل 3 مل حظر في لوحة ستة جيدا تتألف من 10 مل مصل الماعز ، 0.75 مل تريتون X - 100 ، و 89.25 مل PBS.
      1. وينبغي أن مصل لعرقلة الحل يأتي من الأنواع نفسها التي أثيرت الضد الثانوية.
    5. احتضان شريحة الثقافات بين عشية وضحاها في الضد الأولية مخففة في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية.
      1. يجب أن الحد الأقصى لحجم الأجسام المضادة الأولية عن حل الزجاج الصغيرة الآبار طبق بيركس أن حجم 0.3 مل أعلى تميل الى دهس حافة اللوحة.
      2. مكان الطبق في وعاء مغلق مرطب. نحن لا تغطي الطبق مع فيلم قد يكون ملتصق منذ نسج المقاطع على الفيلم المغطي لworkup وخسر أخرى.
      3. ضبط سرعة الهز شاكر لوحة مرتفعة بما يكفي لتعميمها في حل شرائح الأضداد.
    6. إزالة الشرائح من لوحة من الزجاج ، ويغسل في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل يغسل.
    7. احتضان الشرائح في الضد الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في حين تهتز.
      1. استخدام أطباق صغيرة زجاج بيركس لتحميل 0.3 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية.
    8. يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 دقيقة لكل يغسل.
    9. تصور تلطيخ مع 3' - diaminobenzidine (DAB).
      1. حل 30 ملغ في DAB سلفوكسيد 3 مل ثنائي ميثيل.
      2. تصفية DAB باستخدام اثنين # 1 أوراق الترشيح ويغسل مع PBS 54 مل.
      3. فورا قبل الاستخدام ، إضافة 20 ميكرولتر من 30 ٪ H 2 O 2.
      4. احتضان الثقافات في حل DAB للدقيقة 5-7 في درجة حرارة الغرفة.
      5. ملاحظة : DAB هي مادة مسرطنة ويجب التخلص منها بشكل صحيح. التخلص من جميع الحلول DAB في حاوية تخزين ملحوظ في غطاء الدخان ، وإخضاع جميع الأطباق في محلول التبييض تنشيط DAB. وينبغي في نهاية المطاف كل الحلول DAB يتم تجاهل عبر مكتب السلامة المؤسسية.
    10. تغسل شريحة الثقافات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    11. الرطب الثقافات شريحة جبل لجيلاتين (أو سيلاني) الشرائح المغلفة مع 100 ميكرولتر صحن الصابون المذاب في الماء المقطر. بين عشية وضحاها الجاف في درجة حرارة الغرفة.
      1. قد تجنب استخدام تدفئة الشريحة الحرارة المفرطة تسبب تصدع في الثقافات التي شنت على الشرائح.
    12. يذوى الشرائح من خلال سلسلة من الايثانول متدرج (50 ، 75 ، 95 ، 95 ، 100 ، 100 ٪) لمدة 30 ثانية لكل منهما.
    13. واضح مع الشرائح أربع مرات لمدة عشر دقائق الزيلين لكل منهما.
    14. باستخدام ماصة باستير الزجاج ، ضع 0.1 مل من وسائل الاعلام المتزايدة على أعلى شريحة وساترة بلطف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. بين عشية وضحاها الجاف في درجة حرارة الغرفة.
  3. فلوري immunostaining.
    1. ثقافات شريحة المقطع إلى 20 ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد.
      1. ضبط إعدادات ناظم البرد إلى -16 درجة مئوية لدرجة الحرارة الداخلية ، و-12 درجة مئوية لدرجة حرارة الجسم.
      2. ضع كمية صغيرة من المياه المعدنية التي تستخدم في تشوك ماصة باستير وتجميد الثلج الجاف.
      3. تطبيق طبقة رقيقة من نسيج القرص تيك وسائل الإعلام على رأس تشوك المجمدة.
      4. تسمح تشاك لتجميد وإلى درجة حرارة الغرفة يوازن ناظم البرد.
      5. قسم الأنسجة تيك وسائل الاعلام لخلق سطح بالارض مناسبة لزرع شريحة الثقافات المسطحة.
      6. لاحظ اتجاه تشوك بينما sectioning هذا يوفر زاوية متسقة لsectioning التي من شأنها أن تمنع وسائل الاعلام متزايدة من السقوط في تشوك.
      7. عندما المجمدة ، وتتخذ من تشاك ومكان في حامل. تستخدم ملعقة معدنية والطلاء غيض غرامة فرشاة ، الشريحة ثقافة واحدة على شريحة ونقل أكثر من ملعقة إلىوسط طبقة من الأنسجة بالارض تيك وسائل الاعلام على تشاك.
      8. وضع طبقة رقيقة من الأنسجة تيك وسائل الإعلام التي شنت على مدى ثقافة شريحة وتجميد في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
      9. مع "تقليم" الزر المنشط ، والقسم العلوي من طبقات الأنسجة تيك وسائل الاعلام حتى ثقافة شريحة غير مرئية.
      10. التحول من "تقليم" لإعداد مسبق "القسم" في 20 ميكرون.
      11. البيك اب 20 ميكرومتر مع أقسام الجيلاتين المغلفة الشرائح التي هي درجة حرارة الغرفة والشرائح الجافة بين عشية وضحاها.
      12. الأنسجة وسائل الاعلام تك سوف تكون مرئية على الشرائح ، ولكن يذوب في برنامج تلفزيوني يغسل.
    2. Immunostaining.
      1. يغسل ثلاث مرات الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      2. في إخماد 0.3 ٪ H 2 O 2 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، والهز.
      3. يغسل ثلاث مرات الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      4. SFX باستخدام إشارة محسن ، وتطبيق بضع قطرات من مكون مباشرة في أعلى الأقسام في الشريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب.
        • الحضانة مع عنصر يستبدل الخطوة عرقلة الحل مع الماعز 10 ٪ مصل المناعية التي أجريت في مجال مشرق.
      5. الشرائح في احتضان الضد الأولية مخففة في تريتون 0.75 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.
        • تطبيق الحل الأساسي الضد مباشرة إلى رأس الشرائح واحتضان غرفة في ترطيب لمنع التبخر.
        • لا تشمل المصل في أي من الحلول الضد فقط استخدام برنامج تلفزيوني وتريتون X - 100.
      6. يغسل ثلاث مرات الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      7. في احتضان الضد الثانوية لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة وحماية الشرائح من الضوء.
        • الطرد المركزي كل الأضداد الفلورسنت الثانوية لمدة 20 دقيقة لمنع أي مجاميع من الوصول إلى حل الأضداد.
        • إعداد الأجسام المضادة باستخدام التخفيفات 0.75 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني.
      8. يغسل ثلاث مرات الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      9. تراجع الشرائح مرة واحدة في الماء المقطر لغسل الأملاح من خارج برنامج تلفزيوني.
      10. الشرائح الجاف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها ، غطت بعيدا عن الضوء.
      11. ساترة الشرائح مع وسائل الاعلام إطالة Antifade.
        • ذوبان الجليد المكون ألف في المايكرويف ل10/05 ثانية وإضافة إلى ما يقرب من 1 مل قارورة من مكونات باء ميكس معا باستخدام ماصة Pastuer ، والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء إلى حل.
        • أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق بسرعة قصوى لإزالة الفقاعات.
        • تطبيق طبقة رقيقة من إطالة سائل الإعلام لأعلى الشرائح باستخدام ماصة Pastuer ، حريصا على تجنب خلق أي فقاعات هواء.
        • زلة تغطية مكان بلطف على أعلى شريحة والجافة بين عشية وضحاها ، غطت بعيدا عن الضوء.
      12. المزدوج التسمية Immunostaining فلوري (الشكل 5).
        1. أداء Immunostaining الفلورسنت على النحو الموصوف أعلاه ، باستثناء كل من الأضداد تمييع الحل الأساسي في الحضانة نفسها.
        2. تمييع كل الأجسام المضادة الثانوية في حل نفسها واحتضان على النحو المبين أعلاه.
        3. أدت فترات الحضانة التسلسلي باستخدام اثنين من الأجسام المضادة في immunostaining تضاءلت.

13. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1. ظهور شريحة الثقافات الحصين والخلايا الدبقية الصغيرة. صورة اليد اليسرى يظهر نضجا نموذجية (أي 21 يوما في المختبر) ثقافة شريحة الحصين وصمة عار مع NeuN (الخضراء) لتوضيح التهندس الخلوي للخلايا العصبية الرئيسية. وتظهر الخلايا العصبية في المناطق الهرمية CA1 وCA3 ودنتأكلت التلفيف (DG) العصبونات إلى اليسار. شريط الحجم هو 250 ميكرون. مشتق صورة اليد اليمنى من المنطقة CA1 ، ويظهر في أعلى السلطة لتوضيح نوعية متفرعة من الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة داخل الثقافات شريحة ناضجة. وتميزت الخلايا التي تحتوي على علامة سطح دبقية صغيرة ، cd11b. شريط النطاق هو 50 ميكرومتر.

الشكل 2
الشكل 2. يتم تحضين الباردة شروط مسبقة العصبية في قرن آمون شريحة الثقافات. Sytox الثقافات مع الأخضر ، وضعت علامة فلوري خلية ميتة. في الصف العلوي يظهر الثقافات ومراقبة صورية الصف السفلي يظهر شرائح يتعرض إلى 28 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. اليد اليسرى ، قبل الشاشة الصور لا تظهر أي إصابة CA1. ويبين الجدول النسبي معايرة الألوان في صورة إصابة الجزء العلوي الأيسر. الصور تظهر النسبية منتصف الصف إصابة ثقافة شريحة 24 ساعة بعد التعرض إلى 20 ميكرومتر NMDA. لاحظت أن الإصابة صورية تحكم أكبر من أن يتعرض للثقافات لشروط مسبقة الباردة (CP). تقليديا ، ثم تتعرض الثقافات إلى 20 ميكرومتر NMDA بين عشية وضحاها لتعظيم CA1 مستويات الإصابة العصبية وإصابة قريب من حزب المحافظين ضد صورية ، كما لوحظ أن نسبة إصابة / إصابة القصوى. ومع ذلك ، قد تعرض لاصابة في أقصى المحفزات لن يكون كافيا للتغلب على العصبية من شروط مسبقة. تبعا لذلك ، واستخدام نسب الإصابة / إصابة القصوى قد لا تعكس بدقة العصبية من شروط مسبقة. هذا هو واضح في الصور التي تظهر اليد اليمنى المستويات القصوى CP هي أقل من تلك التي تسيطر صورية.

الشكل 3
الشكل 3. التخطيطي يوضح مدى جدوى استخدام الأولية ، والقياسات اليوم الأول لquantitate مستويات الاصابة في التجارب الباردة شروط مسبقة وكما أشير أعلاه ، وجدنا أن استخدام النسب (الإصابة / إصابة القصوى) يمكن أن يحجب العصبية من البرد تكييف المسبق. ويمكن ملاحظة ذلك من التخطيطي إلى اليسار حيث تظهر الإصابة في الشام الحمراء وذلك بعد الباردة شروط مسبقة في الزرقاء. يوم واحد بعد التعرض NMDA الباردة شروط مسبقة يدل على "3" النسبية مستوى الإصابة ضد صورية ("5") الرقابة ، بما يتفق مع العصبية 40 ٪. ومع ذلك ، إذا تم استخدام الشكل التقليدي باستخدام النسب (أي ضرر / إصابة أقصى) ، أي حماية واضحة [أي ، (5 / 10) = 50 ٪ للضد الشام (3 / 6) = 50 ٪ للشروط مسبقة الباردة ].

الشكل 4
الشكل 4. وتظهر نتيجة Typial qPCR. نسخ الحمض النووي الريبي العليا ضد عدد منحنى دورة عتبة PCR التضخيم تبين الضوابط (الأزرق) والعينات التجريبية (الحمراء). انخفاض الصورة تظهر ملامح التضخيم نموذجي لمدة أربع عينات (الأسود والأخضر والأصفر والبنفسجي). إشعار عتبة ط دورات الأخير (تميزت الخط البرتقالي) تحدث في 26.0 ، 29.5 ، 31.0 ، و 32.5.

الشكل 5
الشكل 5. المزدوج immunostaining التسمية المستخدمة لتأكيد النتائج وqPCR مجموعة qPCR تم تجهيزها للثقافة شريحة IL - 11 (الحمراء) ، وNeuN (الخضراء ، للاحتفال الخلايا العصبية). إلى التحقيق لمواضع التعبير الخلوية من IL - 11. لاحظ أن بعض الخلايا العصبية الهرمية (الأسهم) تظهر IL - 11 و تلطيخ NeuN (الصفراء) في حين أن أصغر الخلايا قليلة (الأسهم) ، يفترض أن تكون الخلايا النجمية ، وتظهر فقط زيادة IL - 11 تلطيخ (الحمراء).

Discussion

وتتضح أهمية أساسية مفهومين المهم ترسيم نظام إشارات خلوى المشاركة في الباردة شروط مسبقة العصبية في أرقام 6 و 7. الأولى ، هي السيتوكينات تركيز منخفض للغاية مما يشير الجزيئات في الدماغ العادي. ومع ذلك ، التغييرات الفسيولوجية تركيز خلوى لديها إمكانات هائلة لتغيير بنية الدماغ ووظيفته (أي النمط الظاهري) وذلك بسبب قدرتها على تغيير التعبير الجيني (الشكل 6). علاوة على ذلك ، والسيتوكينات زائدة للغاية وعديد المظاهر في هذا السيتوكينات متعددة يمكن أن يكون لها آثار مماثلة وخلوى واحد يمكن أن يكون لها تأثيرات متغيرة (الشكل 7). وبالتالي ، لإنشاء بدقة الفطرية ، خلوى أسس العصبية من شروط مسبقة الباردة (أو غيرها من المنبهات الفسيولوجية شروط مسبقة) ، تحليل مركب من المتغيرات ذات الصلة يجب أن يكون إشارة تحدد. ويتم إنجاز ذلك عن طريق فحص الاستراتيجيات المضاعفة. هذا سوف إنشاء خلوى "توقيع" شروط مسبقة الباردة العصبية.

الشكل 6
الشكل 6. قوة إشارات خلوى الدماغ. الرسوم التوضيحية ينقل القوة الهائلة يشير تركيزات الفسيولوجية للدماغ السيتوكينات بالمقارنة مع نظرائهم من تركيزات المعترف بها جيدا الأخرى. ويمثل التركيز على عكس المسافة ، بدءا الطولي القط واحدة كنقطة مرجعية. الصوديوم (10 م -1 يتضح من حبة من الفلفل) والبوتاسيوم (10 م -3 يتضح من الطماطم) موجودة في الفضاء في الدماغ خلالي في مستويات حول 150 و 3 ملم ، على التوالي ، ويكون جيدا في الأدوار المعترف بها وظيفة خلايا العصبية الكهربية. وبالمثل ، ودرجة الحموضة (أي ، ~ 10 -7 M مستويات من أيونات الهيدروجين وكما هو موضح 780 متر على طول بحيره في شيكاغو) والكالسيوم (أي ~ 10 -8 M مستويات كما هو موضح 7.8 كم رأيت من صورة القمر الصناعي على طول بحيره البحث في شيكاغو من ماكورميك مكان إلى نقطة الرعن في هايد بارك بالقرب من جامعة شيكاغو). بالإضافة إلى ذلك ، أصدرت العصبية خلالي الى الفضاء خلال هذه التركيزات المحلية يؤثر نشاط المنطقة من المخ. في المقابل ، يمكن السيتوكينات (كما هو موضح المسافة من الارض الى المريخ) يغير وظيفة المخ في تركيزات أكثر من عشرة ملايين مرات أقل.

الشكل 7
الشكل 7. ويمكن الإشارة التفاعلية الممرات خلوى الفطرية. السيتوكينات هي زائدة عن الحاجة للغاية وعديد المظاهر في هذا السيتوكينات متعددة لها آثار مماثلة وخلوى واحد يمكن أن يكون لها آثار متباينة. هذا التنوع نابع من إشارات التفاعلية المعقدة التي تحدث على مستوى يغاندس ، والمستقبلات ، وphosphoproteins. مزيد من تعقيد ينبع من حقيقة أن المخ يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا ، مع كل من الخلايا قادرة محددة خلوى الفطرية ، ومستقبلة ، والتغيرات بروتين فسفوري ؛ فسوبروتين ذات الصلة. لأغراض التوضيح هنا ، تظهر فقط خلوى الفطرية مسارات إشارات (المستمدة من دراسات الخلايا المناعية). عن البساطة ، ويتم رسمها في المخ مثل خلية واحدة (الخط الأبيض) تظهر التفاعلات المحتملة لالسيتوكينات الفطرية (IL - 1α و IL - 1β (المشار إليه هنا بوصفه IL - 1α / β) ، TNF - α ، IL - 6 ، الإنترفيرون γ و IL - 10) ، والمستقبلات (IL - 1R1 ، TNFR1 ، IL-6/gp130 ، IFNγR وIL - 10R) ، وphosphoproteins (أي تحركات ERK1 / 2 ، P38 (P38 - MAPK) وJNK) وعوامل النسخ (ATF - 2 ، NFκB وSTAT3). على سبيل المثال ، TNF - α عبر إشارات إلى TNFR1 JNK ، P38 MAPK وERK1 2 / ، والذي يطلق التعبير الجيني عن طريق ATF - 2. TNF - α يغير أيضا التعبير الجيني مباشرة من خلال تفعيل NFκB. معا ، وتفعيل هذه العوامل تثير زيادة النسخ (السهم) وانخفاض (نهاية حادة) التعبير عن السيتوكينات ومستقبلاتها على النحو المبين. الأهم من ذلك ، تبين أن هذه المسارات التغييرات في واحدة خلوى (مثلا ، TNF - α) إنتاج تأثير السيتوكينات (مثل IL - 1β) الأخرى. وبالتالي ، لإنشاء بدقة ، خلوى أسس العصبية من شروط مسبقة الباردة ، مصممة تحليل مركب من المتغيرات ذات الصلة يجب أن يكون إشارة. هذا سوف إنشاء الفطرية خلوى "توقيع" شروط مسبقة الباردة. (صورة جمعت من بيانات مرجعية # 25).

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS - 19108) ، ومؤسسة البحوث الصداع النصفي ، ومؤسسة الابيض ريتشارد P. Kraig. السيدة مارسيا P. Kraig ساعد في إعداد وسائل الإعلام والثقافة ، والحفاظ على الثقافات شريحة. نشكر يلينا جرينبرج على تعليقاتها وتنقيحات على النسخة النهائية من هذه المادة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression. Brain Res. 998, 155-163 (2004).
  2. Beattie, E. C. Control of synaptic strength by glial TNFalpha. Science. 295, 2282-2285 (2002).
  3. Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain. J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).
  4. Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression. J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).
  5. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes. J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).
  6. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia. J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).
  7. Caggiano, A. O., Kraig, R. P. Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production. J Neurochem. 72, 565-575 (1999).
  8. Calabrese, E. J. Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications. Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).
  9. Calabrese, E. J. Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework. Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).
  10. Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. Hormesis: the dose-response revolution. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).
  11. Hansel, N. N. Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms. Allergy. 63, 366-369 (2008).
  12. Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue. J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).
  13. Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha. J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).
  14. Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture. Glia. 33, 169-179 (2001).
  15. Kraig, R. P. TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine. International Dose-Respose Society. , (2010).
  16. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures. J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).
  17. Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).
  18. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo. J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).
  19. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures. J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).
  20. Kunkler, P. E., Kraig, R. P. P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture. Hippocampus. 14, 356-367 (2004).
  21. Lambertsen, K. L. Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).
  22. Lee, J. K. Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response. J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).
  23. Mattson, M. P. Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways. Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).
  24. Ning, B. Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes. J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).
  25. Oppenheim, J., Feldman, M. in Cytokine Reference. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).
  26. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).
  27. Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha. J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).
  28. Stellwagen, D., Malenka, R. C. Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha. Nature. 440, 1054-1059 (2006).
  29. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40, 133-139 (2002).
  30. Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro. Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 43 ، والحصانة الفطرية ، وإنهاض ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، الحصين ، والثقافة ، شريحة ، المناعية ، العصبية المناعة ، والتعبير الجيني ، في الوقت الحقيقي PCR
استراتيجيات لدراسة شروط مسبقة من العصبية الباردة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, H. M., White, D. M.,… More

Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter