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Neuroscience

Estrategias para el Estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento

Published: September 2, 2010 doi: 10.3791/2192
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neurology, The University of Chicago Medical Center

Summary

Tratamos de definir la señalización neuronal inmune responsable de frío preacondicionamiento como medio para identificar nuevas dianas para el desarrollo de terapias para proteger el cerebro antes del inicio de la lesión. Se presentan estrategias para el trabajo de tal manera que requieren los sistemas biológicos, además de las manipulaciones experimentales capacidades técnicas que son altamente reproducible y sensible.

Abstract

Lesión neurológica es una causa frecuente de morbilidad y mortalidad de la anestesia general y la relacionada con los procedimientos quirúrgicos que pueden ser aliviados por el desarrollo de soluciones eficaces, fáciles de administrar y tratamientos seguros del precondicionamiento. Tratamos de definir la señalización neuronal inmune responsable de frío preacondicionamiento como medio para identificar nuevas dianas para el desarrollo de terapias para proteger el cerebro antes del inicio de la lesión. Bajo nivel de pro-inflamatorias mediador de señalización cambia con el tiempo son esenciales para el frío preacondicionamiento neuroprotección. Esta señalización es consistente con los principios básicos de hormesis acondicionado fisiológicas, las cuales requieren que los estímulos irritativos alcanzar una magnitud de umbral con el tiempo suficiente para la adaptación a los estímulos para la protección a hacerse evidente.

En consecuencia, la demarcación de la señalización inmune involucrados en frío preacondicionamiento neuroprotección requiere que los sistemas biológicos y las manipulaciones experimentales más capacidades técnicas son altamente reproducible y sensible. Nuestro enfoque es utilizar las culturas del hipocampo sector como un modelo in vitro que refleje sus homólogos en vivo con multi-sináptica redes neuronales influenciado por madurez y reposo macroglia / microglia. Este estado gliales es particularmente importante para la microglía, ya que son la principal fuente de citoquinas, que son operativos en el rango de femtomolar. Además, las culturas corte se puede mantener in vitro durante varias semanas, que es el tiempo suficiente para provocar la activación de los estímulos y evaluar las respuestas de adaptación. Por último, las condiciones ambientales puede ser controlada con precisión a partir de cultivos rebanada de manera que la señalización de citoquinas de frío preacondicionamiento se puede medir, imitado, y modulada para diseccionar los aspectos nodo crítico. La señalización de citoquinas análisis del sistema requiere el uso de las técnicas de multiplexado sensibles y reproducibles. Nosotros usamos la PCR cuantitativa para el TNF-α a la pantalla de activación de la microglia seguido por cuantitativa en tiempo real de detección amplia qPCR para evaluar todo el tejido de cambios en las citoquinas. Este último es un medio más sensible y reproducible para medir el sistema de señalización de citocinas varios cambios simultáneamente. Los cambios significativos se confirman con qPCR objetivo y la detección de proteínas. Nos sonda de tejido basado en cambios en las proteínas de citocinas con multiplexado ensayos de citometría de flujo utilizando la tecnología de microesferas Luminex. Células específicas de la producción de citocinas está determinada con inmunohistoquímica doble etiqueta. En conjunto, esta preparación del tejido cerebral y el estilo de uso, junto a las estrategias sugeridas de investigación, puede ser un método óptimo para la identificación de objetivos potenciales para el desarrollo de nuevas terapias que podrían imitar las ventajas de frío preacondicionamiento.

Protocol

Técnicas de esterilización y asepsia son fundamentales para la preparación, mantenimiento y utilización de cultivos de corte durante períodos prolongados. Por otra parte, la razón de nuestro uso de cultivos de corte sólo después de 18 días in vitro se basa en la evidencia que indica excitación y la transmisión sináptica inhibitoria se vuelve más maduro, y la glía (astrocitos y microglia) se convierten en reposo y en consonancia con sus homólogos en vivo (Figura 1 ).

1. Preparación y mantenimiento de las Culturas rebanada hipocampo

  1. El mismo día de cultivo, se equilibran inserta estéril en 1,1 ml de medio de crecimiento compuesto de 50 ml de medio basal de Eagle, 25 ml de Earle solución salina balanceada, 23 ml de suero de caballo, de 0,5 ml Glutamax (200 mM de existencias), 0,1 mL de gentamicina (10 mg / ml de caldo), 0,4 mL Fungizone (250 mg / ml), 1,45 ml de D-glucosa (45%, 42 mM totales).
  2. Mantenga seis y bandejas en una incubadora a 36 ° C, el dióxido de carbono al 5% y 95% de humedad.
  3. La esterilidad máxima, el cultivo está muy bien hecho en una habitación con filtros HEPA con cultivo positivo de presión con el aire también se purifica a través de la auto-contenida la luz ultravioleta de limpieza de aire fans, y mientras llevaba una bata de laboratorio limpia y guantes estériles se extendía sobre las mangas de bata de laboratorio .
  4. Preparar cultivos rebanada en una campana de BSL-1 laminar de humos, que incluye todos los materiales necesarios (es decir, el picador McIlwain tejidos, relacionados con insertos de teflón, una hoja de afeitar corte, disección en frío (3-4 ° C) placa, instrumentos quirúrgicos, y la disección de placas de Petri) con una salvaje (M8) estereoscópico.
  5. Deje que la placa de refrigeración (se ejecuta desde un baño de agua cercanas) para llegar a 3.4 ° C de temperatura por lo menos durante 30 minutos, mientras que al mismo tiempo, la exposición de materiales de disección a la luz ultravioleta para establecer aún más la esterilidad de la zona de disección y herramientas.
    1. La campana de flujo laminar es periódicamente examinado para asegurar que la luz ultravioleta tiene el poder suficiente a nivel de mesa con un medidor de luz ultravioleta de onda corta de medición de luz.
  6. Use las crías de rata (P8-P9 y ~ 23 g / ea. Camadas de sacrificadas a 10 en el nacimiento) anestesiadas con dióxido de carbono al 100% en una caja de pequeños animales en un banco de asepsia detrás de la campana de extracción y limpiado por inmersión en etanol al 100% en la campana de extracción, donde todos los pasos posteriores se llevan a cabo.
  7. Decapitar a las crías en un medio de 100 mm placa de Petri y colocar la cabeza en la segunda mitad, con un plato dulce por cachorro.
  8. Diseccionar el cerebro y colocarlo en la mitad inferior de una placa de Petri de 60 mm que contiene 10 ml estéril frío (3-4 ° C) solución salina equilibrada de Gey, complementado con la D-glucosa a 6,5 ​​mg / mL (es decir, 7,5 ml de 45 % d-glucosa por botella de 500 ml de Gey.
  9. Diseccionar el hipocampo de cada hemisferio y colocarlas en un disco de teflón para que el helicóptero McIlwain. Medios de difusión fuera del tejido cerebral usando una espátula de iris para evitar que las secciones de corte del cerebro se adhiera a la hoja de corte.
  10. La sección perpendicular a su eje hipocampo tiempo utilizando el helicóptero McIlwain, con espesor de corte fijado en 350 a 400 micras.
  11. Rápidamente lavar recién cortado rebanadas fuera de las inserciones de teflón y en la mitad superior de una placa de Petri de 60 mm que contienen frío (3-4 ° C) solución salina equilibrada de Gey, con 6,5 mg / ml de D-glucosa mediante una pipeta un ml.
  12. Inspeccione cortes en el microscopio estereoscópico para un giro dentado y intacta la capa de células piramidales.
  13. Con cuidado, coloque la mayor rebanadas en una inserción (tres por insertar y 12 rebanadas / cachorro) y mantener en condiciones normales de incubación en una incubadora limpiarse cada seis meses y calibrarse cada tres meses con un analizador de dióxido de carbono y el termómetro de infrarrojos con un decimal.
  14. Actualizar los medios de cultivo en placas de cultivo cada 3-4 días in vitro utilizando una campana de BSL-2 y una técnica estéril.
  15. Después de 7 días in vitro, reemplazar los medios de comunicación con 1,1 ml de suero libre de los medios de comunicación (SFM) que consta de 97 mL Neurobasal, 2 ml B27, 0,5 mL Glutamax (200 mM), 0,1 ml de ácido ascórbico (0,5 M), y 0,68 ml de D- glucosa (45%, 42 mM totales).

2. Pre-pantalla de vitalidad de las culturas Cortar

  1. Alícuota Sytox Verde Fotos (10 l) y se almacena a -20 ° C.
  2. Diluir acciones Sytox a 500 nm de trabajo de concentración de medios de cultivo libre de suero (es decir, 10 l cada 100 ml de medio). Tienda Sytox los medios de comunicación a 4 ° C y el uso de hasta una semana.
  3. Coloque 1,1 ml de Sytox por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos y caliente a 36 ° C en el dióxido de carbono al 5% durante un período suficiente (es decir, como lo demuestra la falta de condensado en placas de cultivo).
  4. Mientras tanto, permitir que una lámpara ultravioleta (es decir, una fuente de luz fluorescente con un filtro FITC) alimenta a través de una fuente de alimentación estabilizada para asegurar la intensidad de la luz uniforme para calentar a la temperatura de por lo menos 20 min.
  5. Culturas lugar rebanada (18 díass in vitro) en Sytox medios de comunicación durante 10 minutos y luego de vuelta a la ordenación forestal sostenible para la detección de lesiones irreversibles CA1 capa piramidal.
  6. Ver las culturas en una superficie aséptica de un microscopio invertido, se examinan bajo aumento de 5x.
  7. Aceptar las culturas con menos de 30 células Sytox positivo en el área CA1.

3. En frío de preacondicionamiento

  1. Coloque 1,1 ml de la ordenación forestal sostenible en placas de cultivo de 6 pocillos. Permita que el medio enfriado (por ejemplo, 30 ° C) para equilibrar en una incubadora (dióxido de carbono al 5% y 95% de humedad) durante al menos 20 minutos antes de su uso. Ausencia de condensación en placas de cultivo indica que el tiempo necesario para el equilibrio se ha producido.
  2. Transferencia inserta rebanada cultura a los medios de refrigeración (1,1 ml / pocillo) bandeja de mantenerse a 30 ° C e incubar durante 90 min utilizando una técnica estéril en una campana de humos BSL-2.
  3. Coloque las culturas rebanada de nuevo en la ordenación forestal sostenible en las condiciones normales de incubación normal por 24 horas, de nuevo utilizando una técnica estéril a través de una campana de extracción BSL-2.

4. Lesiones excitotóxica

  1. Sometemos a empezar a cortar la cultura de uso experimental mediante la exposición a los medios de comunicación Sytox durante 20 minutos.
    1. Adquirir imágenes individuales rebanada con rodajas de mantenerse en una orientación similar a la utilizada para la preselección (imágenes de fondo). Esto se realiza mediante la colocación de una marca a la izquierda y marca dos a la derecha con rotulador en el "10" y "dos" en punto de cada inserción. Esta maniobra facilita el uso de la misma área de la forma de interés para cada conjunto de imágenes de la cultura.
  2. Al mismo tiempo, a su vez en la fuente de luz ultravioleta (con fuente de alimentación regulada), y una cámara CCD con un mínimo de 20 minutos para que alcance la temperatura.
  3. A continuación, calibrar la cámara CCD con un estándar de fluoresceína.
    1. "Clear" de la CCD mediante la exposición a la luz durante 50 ciclos a menos que calibrar automáticamente la cámara CCD se utiliza. Hemos establecido un programa dentro de MetaMorph para limpiar nuestra cámara Ajustar Cool utilizados para la cuantificación de daños.
    2. Lugar 10 l de fluoresceína en 90 ml de PBS (tampón fosfato 10 mM, NaCl 150 mM a pH 7.3) y agitar.
    3. Pipeta de 10 l de mezcla de fluoresceína en un hemocitómetro 100 m de profundidad.
    4. Ajustar la intensidad de la imagen completa para 1000/4096.
  4. Recoge imágenes de fondo de las culturas de división para verificar que en frío preacondicionamiento no causó daño (es decir, descartar las culturas con ≥ 250 CA1 zona de intensidad de interés).
  5. Preparar las bandejas con NMDA.
    1. Prepare la solución madre 10 mM de NMDA por lo menos una vez por semana.
    2. Por lesión excitotóxica, diluir NMDA a 20 50 M en la ordenación forestal sostenible y equilibrar las condiciones de incubación normal por lo menos 20 min.
  6. Usar la campana BSL-2 y una técnica estéril, se inserta en el lugar NMDA-media durante 60 minutos bajo condiciones de incubación normal.
  7. Enjuague NMDA fuera de insertos por inmersión de cada inserción tres veces en tres diferentes placas de 60 mm cada uno con 10 ml Neurobasal calentado a 36 ° C. No use más de tres inserciones para cada conjunto de tres placas de 60 mm de lavado.
  8. Volver culturas a las condiciones de incubación normal.
  9. Recoge imágenes de lesión 24 horas después de la exposición a NMDA.
    1. Calibrar la cámara con fluoresceína tipo descritos anteriormente.
    2. Culturas lugar en los medios de comunicación Sytox durante 20 minutos.
  10. Cuantificar la lesión:
    1. El uso de software MetaMorph, dibuje una zona de interés alrededor de CA1 región.
    2. Medir la intensidad de la región seleccionada para un "daño".
    3. Copiar y pegar desde AOI "daño" a "fondo" de la imagen.
    4. Introduzca los valores de "daño" y "origen" en Excel.
    5. Cuantificar "numerador-fondo" para el Control y la cultura en frío previo de adaptación.
    6. El uso de software estadístico (por ejemplo, SigmaStat), ejecute pruebas estadísticas apropiadas para comparar lesión del grupo experimental (s) versus un grupo control, que siempre debe ser incluido con cada corrida experimental.
    7. Nota: Si los niveles de lesión son bajas en un día después de la lesión imágenes, llevar a cabo el experimento, a dos de tres días. La protección de las culturas pueden estar enmascarados por la falta de susceptibilidad a la lesión (Figura 2).
    8. Nota: El tema de la "protección" nos llevó a pasar a los niveles de daño de medición y no proporciones para todas las comparaciones (Figura 3).

5. Co-tratamientos aplicados en frío con el precondicionamiento

Una ventaja importante de las culturas sector es que las condiciones ambientaless puede ser controlada con precisión. Esto significa que la señalización de citoquinas de frío preacondicionamiento se puede medir, imitado, y modulada para diseccionar los aspectos nodo crítico.

  1. Recombinantes (por ejemplo, el agonista), las proteínas y la neutralización de las proteínas (por ejemplo, anticuerpos o receptores solubles) se puede utilizar para imitar y modular, respectivamente, la señalización de citoquinas.
  2. En general, estas proteínas se reconstituye y se almacena en alícuotas a -20 ° C para su uso dentro de seis meses para asegurar la bioactividad adecuada.
  3. Aquí se describe el uso ejemplar de TNF-α abrogación de señalización con el receptor soluble de TNF 1 (sTNFR1).
    1. Reconstituir sTNFR1 en el 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS a una población de 50 mg / ml, alícuotas de 20-50 l cantidades, y se almacena a -20 ° C.
    2. Para su uso, diluir sTNFR1 a 200 ng / mL en los medios de corte culturas crecimiento calentado a 36 ° C y las culturas en lugar de cortar sTNFR1 medios de comunicación durante 20 minutos antes de la fría preacondicionamiento.
      1. Nota: Para reducir la varianza, lo mejor es diluir 200 ng / mL sTNFR1 en un gran volumen de medios de cultivo (por ejemplo, 1:250 dilución de 50 mg / ml sTNFR1 acciones en 10 ml de medio de cultivo requiere 40 l sTNFR1) vs añadiendo sTNFR1 directamente a cada pocillo en el plato (4,4 l por 1,1 ml de medio).
    3. Diluir sTNFR1 a 200 ng / mL en los medios de comunicación y el lugar de 1,1 mL en cada inserción, así. Permita que el medio se equilibre a 30 ° C durante al menos 20 minutos antes de la exposición de las culturas de corte en frío de preacondicionamiento de 90 minutos como se describió anteriormente.
    4. Culturas lugar rebanada de nuevo a 36 ° C con sTNFR1 presente en los medios de comunicación.
    5. 24 horas más tarde, exponer las culturas a los medios de comunicación Sytox durante 20 minutos como se describió previamente y recoger las imágenes de fondo para verificar que el frío-preacondicionamiento no dañar las culturas.
  4. Cuantificar los datos como se describe anteriormente.
  5. Actualizar los medios de comunicación con los componentes de cada 3-4 días in vitro.

6. Lesiones excitotóxica inmediata y retardada después en frío preacondicionamiento

  1. Daño inmediato con frío preacondicionamiento.
    1. Realizar en frío preacondicionamiento como se describió anteriormente.
      1. Después de frío preacondicionamiento, el retorno a las culturas normal de incubación durante 20 minutos.
      2. A continuación, exponer las culturas a las lesiones M 20-50 NMDA durante una hora.
      3. Enjuague tres veces las culturas como se describe arriba y volver a la normal de incubación.
      4. Después de 24 horas, adquirir fotos lesión como se describió anteriormente.
  2. Efectos retardados de frío preacondicionamiento.
    1. Realizar en frío preacondicionamiento como se describió anteriormente.
    2. Exponer las culturas a las lesiones NMDA 24 horas después, como se describió anteriormente.
    3. Seguir para obtener imágenes de lesiones de hasta tres días después de los primeros fríos-preacondicionamiento para supervisar la protección.

7. Aislamiento del ARN

Los procedimientos siguientes de expresión génica se escalan para una cultura de corte único.

  1. Transferencia de las culturas sector a partir de medios de cultivo e incubación normal RNAlater 3 ml a los 6 y placas de cultivo para estabilizar el ARN. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de tres días hasta que son procesados ​​como se describe a continuación.
  2. Con cuidado, levante la cultura rebanar la inserción con un pincel de punta fina de pintura y el lugar en 1 ml de frío (4 ° C) PBS en un 1,5 ml (DNasa, RNasa y libres de ADN) tubo de microcentrífuga.
  3. Centrifugar las muestras durante 30 segundos y eliminar el sobrenadante PBS.
  4. Almacene las muestras a -80 ° C.
  5. Para aislar el ARN de las culturas rebanada (~ 250 ng / ea.), Las muestras de deshielo en el hielo.
  6. Aislar ARN utilizando el kit Qiagen MicroRNeasy a través de los siguientes procedimientos que se describen en mayor detalle y adaptado del Manual RNeasy Micro (Qiagen).
    1. Lugar 350 RLT buffer l (con 10 l β-mercaptoetanol por ml) en cada tubo de microcentrífuga que contiene una cultura de corte.
    2. Homogeneizar las muestras mediante agitación durante 30 segundos. Triturar el tejido, si es necesario (es decir, el tejido de pellets todavía visible) utilizando un mortero hasta que estén completamente disponibles homogeneizados en tampón RLT.
    3. Colocar 350 l de etanol al 70% en la mezcla de lisado y la pipeta para mezclar.
    4. Transferencia de homogeneizado de una columna de centrifugación y el lugar en un tubo de recogida (ambos spin columna y el tubo de recogida son proporcionados por Qiagen).
    5. Centrifugar la muestra durante 15 segundos a velocidad máxima. Conservar la columna.
    6. Lavar la columna giro mediante la adición de 350 RW1 Buffer l más centrifugar durante 15 segundos a velocidad máxima. Deseche buffer.
    7. Diluir 10 l de DNasa I en 70 acciones de búfer l RDD para producir 80 l volumen total. Pipeta suavemente para mezclar no vórtice. Preparar 80 L de acciones diluidas DNasa por muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    8. Añadir 350 l de buffer RW1 muestra spin columna y centrifugar durante 15 segundos. Deseche el tubo de recogida.
    9. El uso de un tubo de recogida de nuevo, añadir 500 l de buffer RPE de la muestra y centrifugar durante 15 segundos y descartar buffer.
    10. Colocar 500 l de etanol al 80% de la muestra y centrifugar durante 2 min. Deseche el tubo de recogida.
    11. Seque el spin columnas por centrifugación durante 5 minutos a máxima velocidad con tapas de tubo abierto, deseche los tubos de recolección, y la columna de la transferencia de spin en un tubo de 1,5 ml de recogida suministrado en el kit.
    12. Para recoger el ARN aislado, el lugar 14 l RNasa libre de agua en el centro de la membrana spin columna. Centrifugar durante un minuto y recoger el líquido.
    13. Añadir 2 l de RNasin (diluido al 1 U / mL en buffer TE) y almacenar a -80 ° C. TE buffer consta de 10 mM Tris (tris [hidroximetil] aminometano), 1 mM EDTA (ácido etilendiaminotetraacético sal hidratada disódico) en el 8,0 pH.

8. La cuantificación del ARN

  1. Nota: RNasin no interfiere con el ensayo RiboGreen.
  2. Diluir 1:200 RiboGreen en RNasa libre de buffer TE de la siguiente manera.
    1. TE (ml): 1; Ribogreen (l): 5;
    2. TE (ml): 4; Ribogreen (l): 20;
    3. TE (ml): 6; Ribogreen (l): 30.
  3. Normas de ARN se preparan como sigue.
    1. TRNA de levadura se utiliza como el estándar de ARN. tRNA se almacena (-20 ° C) y 1 mg / mL en buffer TE.
    2. Diluir de 1 mg / ml de caldo de 1:100 en buffer TE, usando (DNasa, RNasa y ADN libre) 1,5 ml tubos de microcentrífuga para producir un 1 mg / ml de trabajo estándar.
    3. Preparar la curva de calibración directamente en una placa de 96 pocillos fluorescencia añadiendo el buffer TE diluyente, luego añadir la cantidad apropiada de 1 mg / ml estándar en el buffer TE ya en los pozos de la placa como se muestra en la tabla adjunta. Hacer duplicados de los pozos, ya que cada nivel siguiente.
      1. Vol. de enfermedades de transmisión sexual. (L): 100, vol. de la TE (l): 0; ARN y (ng): 100;
      2. Vol. de enfermedades de transmisión sexual. (L): 80, vol. de la TE (l): 20; ARN y (ng): 80;
      3. Vol. de enfermedades de transmisión sexual. (L): 60, vol. de la TE (l): 40; ARN y (ng): 60;
      4. Vol. de enfermedades de transmisión sexual. (L): 40, vol. de la TE (l): 60; ARN y (ng): 40;
      5. Vol. de enfermedades de transmisión sexual. (L): 20, vol. de la TE (l): 80; ARN y (ng): 20;
      6. Vol. de enfermedades de transmisión sexual. (L): 0, vol. de la TE (l): 0; ARN y (ng): 0.
  4. El ensayo se prepara de la siguiente manera.
    1. Añadir 99 l de tampón TE para cada uno de los pocillos de la placa de 96 pocillos. La manera más eficaz de hacerlo es utilizar una pipeta multicanal.
    2. Añadir 1 L de ARN de los pozos de la muestra experimental.
    3. Añadir 100 ml de la RiboGreen diluido a cada pocillo con la pipeta multicanal y triturar con uno o dos golpes de la pipeta.
    4. Leer la placa en un lector de placas fluorescentes en nm de excitación 480 y 520 nm de emisión.
    5. Construya una curva estándar utilizando Microsoft Excel con la medida de intensidad de fluorescencia de las normas de ARN.
    6. Calcular las concentraciones de ARN en las muestras usando la ecuación lineal resultante de la curva de las normas.

9. SYBR Green PCR cuantitativa

  1. Los procedimientos de PCR se realiza mejor en un lugar limpio y reservado específicamente para trabajar con RNA (Figura 4).
    1. Descontaminar el área y equipo de laboratorio relacionados con la contaminación de ADN potencial y la actividad RNasa antes de su uso con luz ultravioleta, el 10% de lejía o RNasa lejos.
    2. Use guantes en todos los procedimientos.
    3. El uso del agua RNasa libre para todos los procedimientos conforme a lo dispuesto en el kit. No utilice DEPC (dietilpirocarbonato) agua tratada.
    4. Cerrar todos los tubos de PCR de manera inmediata después de su uso a la contaminación de aerosoles retardo de ADN extraño.
  2. Desarrollar y caracterizar los cebadores para el ARNm objetivo (s) de interés. Estos métodos se detallan en los métodos complementarios para Hulse et al., Journal of Neuroscience, 2008 13.
  3. cDNA se produce 30 a 200 ng de ARN total por transcripción reversa utilizando iScript.
    1. La elección de la cantidad de ARN de partida se determina por la cantidad total de ARN disponibles con el objetivo de realizar análisis RT-PCR en una parte de la muestra (es decir, 10% -20% del total).
    2. La porción restante más grande de ARN se almacena para su posterior análisis.
    3. El kit iScript utiliza una mezcla de hexámeros al azar y cebadores oligo-dT, y una modificación de la transcriptasa inversa MMLV en un volumen total de 20 mL.
    4. Invertir el producto de transcripción de los 25 ° C durante 30 min seguido de 42 ° C durante 50 minutos, y la transcriptasa inversa es posteriormente desnaturalizado a 85 ° C durante 5 min.
    5. Diluir cDNA en buffer TE a una concentración final de 0,4 en relación ng / l para iniciar la cantidad de ARN.
  4. SYBR Green estrategia basado en la PCR se utiliza para amplificar cDNA.
    1. Las reacciones de PCR se monitorean en tiempo real mediante el control de la incorporación SYBR Green.
    2. El 50 reacciones l contiene 3 mM MgCl 2, dNTPs 200 mM, 15 pmol de cada uno de adelante y atrás, una M fluoresceína, 1x colorante SYBR Green, 10 l (4 ng) cultura rebanada cDNA, y 1,25 U Taq polimerasa de platino en la reacción buffer compuesto por 50 mM KCl y 10 mM Tris, pH 8,3.
    3. PCR se realiza utilizando el termociclador iCycler que puede recoger los datos en tiempo real.
    4. Parámetros de los ciclos constan de 15 segundos de desnaturalización (95 ° C), seguido de 30 segundos hibridación / extensión (60 ° C) repite 45 veces.
    5. Las mediciones ópticas se toman durante el paso de hibridación / extensión y los valores de Ct se determinaron utilizando el software del sistema iCycler.
    6. cDNA para los objetivos de citoquinas de interés y β-actina se utilizan para construir las curvas de calibración.
      1. El número de copias se determina por el peso molecular y la masa del plásmido cDNA.
      2. Las curvas de calibración del número de copias / masa se construyen y se incluyeron en cada ensayo.
      3. Los valores de Ct para cada dilución de cDNA se utilizan para determinar el número de copias v. Ct curva.
    7. Citoquinas y β-actina niveles el número de copias se determinan para las muestras con las curvas de calibración.

10. PCR cuantitativa de Microarrays

Cuantitativa en tiempo real de detección amplia qPCR es un medio muy sensible y reproducible para la sonda de bajo nivel de cambios inflamatorios mediador expresión.

  1. La RT2 Profiler serie PCR de SABiosciences se utiliza para los cambios inflamatorios mediador expresión de los genes, con los siguientes pasos se describe con más detalle por el fabricante.
  2. El ensayo utiliza 0.1-1.0 mg de ARN. Usamos las áreas locales corte (por ejemplo, CA1, que proporciona ~ 250 ng de ARN total a partir de dos muestras combinadas) o en su totalidad las rebanadas individuales que contienen una cantidad similar de ARN total.
  3. ARN de muestras y control se transcriben de forma inversa a cDNA utilizando un kit de la primera cadena (por ejemplo, # C-03).
    1. La resultante de cDNA se mezcla con SYBR Green PCR basada en la mezcla (# PA-011) y 25 l alícuotas en cada uno de los 96 pozos de la placa de matriz de PCR (que mide 84 genes únicos experimental y 16 genes de la casa).
    2. Una placa matriz se prepara para la muestra experimental y un segundo plato se prepara para el control.
    3. Nota: La mezcla SYBR Green maestro proporcionado por el fabricante es termociclador específicos.
  4. Ciclo térmico se realiza mediante un iCycler con un protocolo de ciclo de 40 que consta de un paso de desnaturalización de 15 segundos a 95 ° C seguido por un paso de extensión de un minutos a 60 º C. Los datos ópticos se recoge durante la etapa de extensión. Ciclos térmicos es seguido por análisis de la curva de exploración de la fusión 55-95 ° Rango de temperatura de 0,5 ° C en incrementos de C.
  5. La expresión relativa de los genes en las placas de tratamiento y de control se determinó utilizando el 2 - Método de ΔΔCt utilizando el software suministrado basado en Excel y se expresa como un aumento del doble o disminución respecto a los controles.
  6. Genes con dos veces el aumento o disminución en la expresión se consideran para su posterior evaluación.
  7. Los genes identificados a partir del examen conjunto de PCR (por ejemplo, usando # PARN-011A para el frío preacondicionamiento) son más confirmed utilizando qPCR.
    1. Matrices PCR identificar qué genes están regulados en respuesta a estímulos.
    2. En el ejemplo de frío de preacondicionamiento, hemos identificado el gen IL-11 como positiva regulada en respuesta al frío-preacondicionamiento.
    3. El siguiente paso en el análisis para confirmar que el gen recientemente identificado está regulado en las culturas sector mediante el ensayo qPCR se detalla más arriba.

11. Flujo multiplexado microesferas citometría de ensayo Proteómica

  1. Exponer las culturas corte en frío pre-acondicionamiento como se describió anteriormente.
  2. Culturas de la cosecha rebanada de ensayo de la proteína total.
    1. Levante suavemente las rebanadas de la inserción con un pincel de punta fina y el lugar en 1 ml de frío (4 ° C) PBS.
    2. Tubos de centrífuga y eliminar PBS de culturas rebanada. Colocar en hielo seco hasta la cosecha ha terminado.
    3. Tubos de almacenar a -80 ° C.
  3. Homogeneizar las muestras de corte cultural para la realización de un ensayo de la proteína total.
    1. Prepare el buffer de lisis celular para la homogeneización.
      1. Siguiendo las instrucciones del fabricante (Bio-Rad), añadir inhibidores de la proteasa a 5 ml de solución amortiguadora de lisis y dejar de lado en el hielo.
    2. Colocar 100 L de tampón de lisis en cultivos de corte y las rodajas de agitar pipeteando arriba y hacia abajo cinco veces con una pipeta 100 L a cielo abierto de 1 mm.
    3. Agitar las muestras en el agitador de placas a 4 ° C durante 20 min.
    4. Centrifugar las muestras a 13.000 rpm durante 15 min a 4 ° C.
    5. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y dejar de lado en el hielo.
  4. Realizar análisis de la proteína total.
    1. Prepare BSA (albúmina de suero bovino) las normas de proteínas.
      1. Reconstituir acciones de BSA con agua ultrapura según las instrucciones del fabricante.
      2. Elaborar normas de proteínas que van 0000-1000 mg / ml, diluido en solución amortiguadora de lisis.
    2. Calcular el volumen de reactivo de trabajo necesarios de acuerdo a las instrucciones del kit.
      1. Por ejemplo, (ocho normas + 18 muestras desconocidas) x (dos repeticiones) x (200 l de reactivo de trabajo requerido por muestra) = 10,4 ml de volumen total de reactivo de trabajo requerido para cargar en una microplaca de 96 pocillos (por ejemplo, el ensayo de citometría de flujo de las microesferas , ver más abajo).
      2. Cuando la mezcla de reactivos con un reactivo B, algunos puede aparecer cierta turbidez, pero debe desaparecer en breve.
    3. Carga de 10 l de patrones y muestras en microplacas.
    4. Cargar 0,2 ml de reactivo de trabajo en los pozos.
    5. Cubrir la microplaca con cinta aislante y agitar en agitador de placas durante 30 segundos.
    6. Incubar de microplacas a 37 ° C durante 30 min.
    7. Microplaca enfriar a temperatura ambiente (unos 10 minutos) antes de leer en un lector de placas a la longitud de onda de 595 nm.
    8. Construya una curva estándar utilizando Microsoft Excel con absorbancias medidas de las normas de la BSA.
    9. Calcular las concentraciones de proteínas en las muestras mediante la ecuación lineal resultante de la curva de las normas.
      1. Diluir todas las muestras para la concentración más baja medida con solución amortiguadora de lisis y almacenar a -80 ° C.
  5. Realizar cálculos complejos y el tejido de citoquinas multiplex (o fluido) los ensayos tal como se indica en el detalle completo de las referencias # 12 y 16.

12. Inmunohistoquímica

  1. Fix culturas durante 24 horas con el fijador PLP que consta de 10 mL de paraformaldehído al 16%, 1,096 g de lisina, 0,42 g de fosfato de sodio y 0,17 g de peryodato de sodio, lleno hasta un volumen total de 80 ml con agua ultrapura (fijador es de 6,2 pH).
    1. Nos encontramos con que el fijador PLP es un fijador suave que permite la detección de bajo nivel inmunotinción que de otro modo no serían evidentes usando otros fijadores.
    2. Las culturas son fijos durante 24 horas y luego fue trasladado con un pincel fino a la azida de sodio que contiene PBS (100 mg / L).
  2. Inmunotinción brillante campo de culturas flotante rebanada se lleva a cabo de la siguiente manera con todos los pasos, junto a la agitación a ~ 50 rpm.
    1. Lávese las culturas rebanada en 3 ml de PBS tres veces durante 10 min.
    2. Apagar las culturas corte en el 0,3% H 2 O 2.
      1. Diluir 30% de H 2 O 2 en PBS solución madre.
    3. Lávese las culturas de división en PBS tres veces, a 10 minutos cada uno.
    4. Bloquear las culturas corte durante una hora a temperatura ambiente en 3 ml de solución de bloqueo en una placa de seis y que consta de 10 ml de suero de cabra, 0,75 ml de Triton X-100 y 89,25 ml de PBS.
      1. De suero para la solución de bloqueo debe provenir de la misma especie en que se planteó el anticuerpo secundario.
    5. Incubar los cultivos durante la noche en el corte anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo a 4 ° C.
      1. El volumen máximo de solución de anticuerpo primario para los pequeños de vidrio Pyrex plato de pozos debe ser de 0,3 ml de volumen más altos tienden a correr por el borde de la placa.
      2. Coloque el plato en un recipiente cerrado húmedo. No cubrimos el plato con film adherente ya que las secciones puedan ser hilado en la película que recubre y se pierde por otro tipo de análisis.
      3. Ajuste de la velocidad de agitación agitador de placas a una altura suficiente para hacer circular las rebanadas en la solución de anticuerpos.
    6. Quitar las rebanadas de placa de vidrio y lavar con PBS tres veces durante 10 min por lavado.
    7. Incubar las rebanadas en secundaria de anticuerpos a temperatura ambiente durante una hora mientras se agita.
      1. Utilice platos pequeños de vidrio Pyrex de 0,3 ml de solución de carga secundaria de anticuerpos.
    8. Lavar tres veces en PBS, 10 min por lavado.
    9. Visualizar la tinción con 3'-diaminobenzidina (DAB).
      1. Disolver 30 mg DAB en 3 ml de dimetilsulfóxido.
      2. Filtro DAB con dos # 1 papel de filtro y lavar con 54 ml de PBS.
      3. Inmediatamente antes de su uso, se añaden 20 l de 30% de H 2 O 2.
      4. Incubar los cultivos en la solución de DAB para 5-7 min a temperatura ambiente.
      5. Nota: DAB es un carcinógeno y debe ser eliminado de forma adecuada. Disponer de todas las soluciones de DAB en un contenedor marcado almacenados en una campana de extracción, y el lugar todos los platos en una solución de lejía para desactivar DAB. Todas las soluciones de DAB en última instancia, debe ser desechada a través de la Oficina de Seguridad Institucional.
    10. Lávese las culturas de división en PBS tres veces durante 10 minutos cada uno.
    11. En fresco culturas trozo de gelatina (o silano) portaobjetos recubiertos con 100 l jabón disuelto en agua destilada. Secar durante la noche a temperatura ambiente.
      1. Evite el uso de calentadores de diapositivas calor excesivo puede causar grietas en las culturas montado en diapositivas.
    12. Deshidratar desliza a través de una serie de etanol clasificado (50, 75, 95, 95, 100, 100%) durante 30 segundos cada uno.
    13. Diapositivas claro con xileno cuatro veces durante diez minutos cada uno.
    14. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, coloque 0.1 ml de medio de montaje en la parte superior de la diapositiva y suavemente el cubreobjetos para evitar burbujas de aire. Secar durante la noche a temperatura ambiente.
  3. Tinción fluorescente.
    1. Culturas de sección y 20 micras de espesor con un criostato.
      1. Ajustar la configuración de criostato a -16 ° C de temperatura interna, y -12 ° C para la temperatura del objeto.
      2. Coloque una pequeña cantidad de agua en el metal plato con una pipeta Pasteur y la congelación en hielo seco.
      3. Aplique una capa delgada de disco tejido Tek-media en la parte superior del plato congelado.
      4. Permitir mandril para congelar y alcancen la temperatura de la cámara del criostato.
      5. Sección Tissue-Tek los medios de comunicación para crear una superficie plana adecuada para la colocación de las culturas porción plana.
      6. Tenga en cuenta la orientación del plato, mientras que el corte esta proporciona un ángulo constante de corte que evitar que el material de montaje de la caída de la tirada.
      7. Cuando se congela, toma patitas en la calle y el lugar en un soporte. Usando una espátula de metal y un pincel de punta fina, deslice una cultura de corte en la espátula y la transferencia a lamedio de la capa plana de tejido Tek-media en el plato.
      8. Coloque una capa delgada de Tissue-Tek los medios de comunicación sobre la cultura corte montada y congelar a temperatura de la cámara por lo menos 10 min.
      9. Con el "trim" botón activado, la sección de las capas superiores de los medios de comunicación Tek, hasta la cultura del tejido sector está visible.
      10. Cambiar de "ajuste" a la "sección" preset a 20 micras.
      11. Pick-up 20 secciones micras con gelatina revestida de diapositivas que son la temperatura ambiente y se desliza en seco durante la noche.
      12. Tissue-Tek los medios de comunicación será visible en las diapositivas, pero se disuelve en lavados con PBS.
    2. Inmunotinción.
      1. Lavar los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno.
      2. Apagar en el 0,3% de H 2 O 2 durante 15 minutos a temperatura ambiente, agitando.
      3. Lavar los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno.
      4. SFX utilizando la señal de reforzador, se aplican unas gotas de un componente directamente en la parte superior de las secciones de la diapositiva y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
        • La incubación con el componente A reemplaza al paso con una solución de bloqueo de cabra 10% de suero a cabo en la inmunohistoquímica de campo claro.
      5. Diapositivas se incuban en anticuerpo primario diluido en 0,75% Triton X-100 en PBS durante dos horas a 37 º C.
        • Aplique una solución de anticuerpo primario directamente a la parte superior de diapositivas y se incuban en cámara húmeda para evitar la evaporación.
        • No incluya en suero en cualquiera de las soluciones de anticuerpos sólo el uso de PBS y Triton X-100.
      6. Lavar los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno.
      7. Se incuban en anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente y proteger a las diapositivas de la luz.
        • Centrifugar todos los anticuerpos secundarios fluorescentes de 20 minutos para evitar que los agregados de entrar en la solución de anticuerpos.
        • Preparar las diluciones de los anticuerpos por medio del 0,75% Triton X-100 en PBS.
      8. Lavar los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno.
      9. Dip se desliza de vez en agua destilada para lavar las sales de PBS.
      10. Diapositivas secar durante la noche a temperatura ambiente, cubierto de la luz.
      11. Cubreobjetos diapositivas con prolongar el programa MEDIA Antifade.
        • Componente descongelar en el microondas por un 5-10 segundos y añadir aproximadamente 1 ml de un vial de Componente B. Mezclar con una pipeta Pastuer, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución.
        • Centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima para eliminar las burbujas.
        • Aplique una capa delgada de prolongar el programa MEDIA de la parte superior de la diapositiva con una pipeta Pastuer, cuidado de evitar la creación de burbujas de aire.
        • Coloque suavemente el cubreobjetos en la parte superior de la diapositiva y secar toda la noche, cubierto de la luz.
      12. Doble etiqueta inmunotinción fluorescente (Figura 5).
        1. Realizar fluorescentes inmunotinción como se describió anteriormente, a excepción de los anticuerpos primarios diluidos en la solución de incubación mismo.
        2. Diluir todos los anticuerpos secundarios en la misma solución e incubar como se describió anteriormente.
        3. Períodos de incubación de serie con dos anticuerpos resultó en disminución de la inmunotinción.

13. Resultados representante

Figura 1
Figura 1. Aparición de las culturas rebanada hipocampo y microglia. La imagen de la izquierda muestra un típico maduro (es decir, 21 días in vitro) la cultura rebanada hipocampo mancha con NeuN (verde) para ilustrar la citoarquitectura de las neuronas principales. Las neuronas piramidales se muestran en las áreas CA1 y CA3 y abolladuracomió giro (DG), las neuronas a la izquierda. Barra de escala es de 250 micras. La imagen de la derecha se deriva de la zona CA1 y se muestra con mayor potencia para ilustrar la calidad de la microglía ramificada en reposo dentro de las culturas tajada madura. Las células fueron marcadas con el marcador de superficie microglial, CD11b. Barra de escala es de 50 micras.

Figura 2
Figura 2. Frío preacondicionamiento neuroprotección en cultivos de corte del hipocampo. Los cultivos se incuban con Sytox Green, un marcador fluorescente marcada de células muertas. La fila superior muestra las culturas simulacro de control y la fila inferior muestra las rebanadas expuestas a 28 ° C durante 90 min. La mano izquierda, pre-pantalla de las imágenes no muestran lesiones CA1. Color en relación lesiones escala de calibración se muestra en la imagen superior izquierda. Imágenes de media fila de manifiesto lesiones en relación la cultura rebanada 24 horas después de la exposición a 20 M de NMDA. Tenga en cuenta que una lesión simulada de control es mayor que la de los cultivos expuestos a frío preacondicionamiento (CP). Tradicionalmente, los cultivos se exponen a 20 M de NMDA durante la noche para maximizar los niveles de daño de las neuronas CA1 y lesiones relativa de CP v. farsa, señaló como una relación de daños / lesiones máxima. Sin embargo, la exposición a los estímulos lesión máxima puede no ser suficiente para superar la neuroprotección de preacondicionamiento. En consecuencia, el uso de relaciones de la lesión / daño máximo es posible que no refleje la neuroprotección de preacondicionamiento. Esto es evidente en las imágenes de la derecha que muestran CP niveles máximos son inferiores a los de los controles sham.

Figura 3
Figura 3. Esquemático que ilustra la utilidad de usar las mediciones iniciales, el primer día para cuantificar los niveles de daño en frío preacondicionamiento experimentos. Como se señaló anteriormente, encontramos que el uso de las relaciones (lesión / lesiones máxima) podría ocultar la neuroprotección de frío de acondicionamiento previo. Esto puede verse en el esquema de la izquierda, donde se muestra una lesión simulada de color rojo y que después en frío preacondicionamiento en azul. Un día después de la exposición a NMDA frío preacondicionamiento muestra un familiar "3" nivel de la lesión v. simulado ("5") de control, en consonancia con el 40% de neuroprotección. Sin embargo, si el formato tradicional mediante las proporciones (es decir, lesión / lesiones máxima) se utiliza, sin protección es evidente [es decir, (5 / 10) = 50% para el simulacro de v. (3 / 6) = 50% para el frío preacondicionamiento ].

Figura 4
Figura 4. Typial resultado qPCR se muestran. Curva superior el número de copias de ARN v. ciclo umbral para la amplificación de PCR que muestran los controles (azul) y las muestras experimentales (rojo). Imagen inferior muestra los perfiles típicos de amplificación para cuatro muestras (negro, verde, amarillo y morado). Observe el segundo ciclo Ct umbral (marcado por la línea naranja) se producen en el 26,0, 29,5, 31,0 y 32,5.

Figura 5
Figura 5. Doble etiqueta inmunotinción para confirmar qPCR y los resultados qPCR amplia de una cultura de corte empleado fue procesado por IL-11 (rojo) y NeuN (verde, para marcar las neuronas). A la sonda para los loci expresión celular de IL-11. Tenga en cuenta que algunas neuronas piramidales (flechas) muestran IL-11 y la tinción NeuN (amarillo), mientras que unas pocas células pequeñas (flechas), se presume que los astrocitos, mostrar sólo el aumento de IL-11 tinción (rojo).

Discussion

Dos conceptos de importancia fundamental importancia a la delimitación del sistema de señalización de citoquinas que participan en frío preacondicionamiento neuroprotección se ilustra en las figuras 6 y 7. En primer lugar, las citoquinas son la concentración extremadamente baja moléculas de señalización en el cerebro normal. Sin embargo, los cambios fisiológicos concentración de citoquinas tienen un inmenso potencial para alterar la estructura y función del cerebro (es decir, el fenotipo), debido a su capacidad para alterar la expresión génica (Figura 6). Además, las citoquinas son altamente redundantes y pleiotrópicos de múltiples citoquinas que pueden tener efectos similares y una citocina sola puede tener efectos diferentes (Figura 7). Por lo tanto, para establecer con precisión la innata citoquinas bases para la neuroprotección del frío-preacondicionamiento (u otros estímulos fisiológicos preacondicionamiento), análisis combinado de las variables relacionadas con la señalización debe ser determinado. Esto se logra a través de estrategias de ensayo multiplex. Esto establecerá la citoquina "firma" de frío preacondicionamiento neuroprotección.

Figura 6
Figura 6. Poder de señalización cerebral de citoquinas. Las ilustraciones de transmitir el inmenso poder de señalización de las concentraciones fisiológicas de las citoquinas cerebrales en comparación con las concentraciones de otros bien conocidos colegas. La concentración es representado como el inverso de la distancia, comenzando con un bigote de gato solo como punto de referencia. De sodio (10 -1 M ilustrado por un grano de pimienta) y potasio (10 -3 M ilustrado por un tomate) están presentes en el espacio intersticial del cerebro a niveles de alrededor de 150 y 3 mm, respectivamente, y tienen bien reconocido papel en la función de las células neuronales electrofisiológicos. Del mismo modo, el pH (es decir, ~ 10 -7 M niveles de iones de hidrógeno y se muestra como 780 metros a lo largo del lago de Chicago) y calcio (es decir, ~ 10 -8 M niveles mostrados como 7,8 kilometros visto desde una imagen de satélite de Google a lo largo del lago de Chicago de McCormick lugar a Promontory Point en Hyde Park, cerca de la Universidad de Chicago). Además, los neurotransmisores liberados al espacio intersticial en estas concentraciones afectan a la actividad local de la región del cerebro. Por el contrario, las citoquinas (que se muestra como la distancia entre la Tierra y Marte) puede alterar la función del cerebro en concentraciones de más de diez millones de veces menos.

Figura 7
Figura 7. La señalización de vías de las citoquinas interactivo innata. Citoquinas son altamente redundantes y pleiotrópicos de múltiples citoquinas que pueden tener efectos similares y una citocina sola puede tener efectos diferentes. Esta diversidad se debe a la señalización complejo interactivo que ocurre en el nivel de los ligandos, los receptores, y fosfoproteínas. Una mayor complejidad deriva del hecho de que el cerebro está formado por diferentes tipos de células, cada una capaz de células específicas de citoquinas innata, receptores, y los cambios relacionados fosfoproteína. Para fines ilustrativos aquí, sólo citoquinas innatas vías de señalización (basada en estudios de células inmunes) se muestran. Para simplificar, el cerebro se dibuja como una sola célula (línea blanca) que muestra las posibles interacciones de las citoquinas innatas (IL-1α e IL-1β (denominado aquí como la IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-10), receptores (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, e IL-10R), y fosfoproteínas (es decir, quinasas ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) y JNK) y factores de transcripción (ATF-2, NFκB, y STAT3). Por ejemplo, el TNF-α a través de señales de TNFR1 de JNK, p38 MAPK y ERK1 / 2, lo que desencadena la expresión de genes a través de ATF-2. TNF-α también altera la expresión de genes directamente a través de la activación de NFκB. En conjunto, la activación de estos factores de transcripción evocar mayor (flecha) y disminuye (extremo romo) la expresión de citoquinas y sus receptores, como se indica. Es importante destacar que estas vías muestran que los cambios en uno de citoquinas (por ejemplo, TNF-α), la producción de la influencia de otros (por ejemplo, IL-1β) citocinas. Por lo tanto, para establecer con precisión la citoquina-bases para la neuroprotección del frío de preacondicionamiento, el análisis de compuesto de variables relacionadas con la señalización debe ser determinado. Esto establecerá la citoquina innata "firma" de preacondicionamiento en frío. (Imagen fue compilado a partir de los datos de referencia # 25.)

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS-19108), la Fundación Migraña Investigación y la Fundación White a Richard P. Kraig. La Sra. Marcia P. Kraig asistencia en la preparación de medios de cultivo y mantenimiento de cultivos de división. Damos las gracias a Yelena Grinberg por sus comentarios y revisiones en una versión final de este artículo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Estrategias para el Estudio de la neuroprotección de frío preacondicionamiento
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Mitchell, H. M., White, D. M.,… More

Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

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