Summary
कॉलोनी सेल परख (सीएफसी) के गठन में इन विट्रो परख में जो hematopoietic progenitors एक अर्द्ध ठोस मध्यम में कालोनियों के रूप में है. कॉलोनी आकारिकी, सेल आकारिकी, और प्रवाह cytometry का एक संयोजन के progenitors के लिए पैदा करना और विभिन्न hematopoietic प्रजातियों के साथ अंतर की क्षमता का आकलन किया जाता है.
Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
- एफएमएस से संबंधित tyrosine kinase 3 के बाँझ 1000x स्टॉक समाधान की तैयारी (फ्लाइट-3), ligand / granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-CSF), स्टेम सेल कारक (SCF), thrombopoietin (TPO), इंटरल्यूकिन -3 (आईएल) , और आईएल -6 निर्माता के निर्देशों के अनुसार. बाँझ Retronectin शेयर (1mg/ml) समाधान भी निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार करें. छोटे aliquots में इन स्टॉक समाधान फूट डालो और -20 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए दोहराया फ्रीज - पिघलना से बचने के लिए.
- IMDM में 2% FBS तैयार.
- 20% FBS की अंतिम सांद्रता, 2 मिमी Glutamine, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी एस) के साथ पूरा IMDM मध्यम तैयार. बस का उपयोग करने से पहले निम्नलिखित साइटोकिन्स जोड़ें: 100 एनजी / एमएल ligand फ्लाइट-3, 20 एनजी / एमएल जीएम-CSF, 100 एनजी / एमएल SCF, 100 TPO एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल आईएल-3, और 100 एनजी / एमएल आईएल 6-.
- HBSS में 1% (Ca और मिलीग्राम मुक्त phenol के लाल के बिना) और डी पीबीएस (सीए और मिलीग्राम मुक्त) में 2% BSA BSA तैयार करें. 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के माध्यम से गुजर द्वारा समाधान जीवाणुरहित
- HBSS और दुकान में 4 बजे 0.02% EDTA तैयार डिग्री सेल्सियस
- Galv pseudotyped retrovirus तैयार -80 पर ब्याज और aliquots में दुकान के डीएनए डिग्री सेल्सियस एन्कोडिंग यह प्रक्रिया इस लेख के दायरे के बाहर है, लेकिन कहीं वर्णित (1-3).
Giemsa धुंधला के लिए
- बस का उपयोग करने से पहले, / राइट Giemsa दाग समाधान 1 एक साफ कांच की बोतल में सुक्ष्ममापी फिल्टर कागजात के माध्यम से दो बार फिल्टर.
- जिओरडनो सूत्र का उपयोग करने से पहले तत्काल / राइट Giemsa बफर पीएच 6.4 फ़िल्टर / राइट Giemsa दाग समाधान और फॉस्फेट समाधान बफर, 6.4 पीएच के 200 मिलीलीटर का 50 मिलीलीटर का मिश्रण से तैयार है.
- 3.5 LH ओ 2 में 2 के.एच. के 27.3 ग्राम पीओ 4 और ना 2 4 HPO की 4.62 ग्राम भंग करके फॉस्फेट समाधान बफर, पीएच 6.0 की तैयारी
- एच 2 ओ में 50% मेथनॉल तैयार
2. प्रक्रिया
विगलन और CD34 के पूर्व सक्रियकरण + कोशिकाओं
- जमी CD34 + कोशिकाओं की एक शीशी 37 जल्दी से पहले गला लें डिग्री सेल्सियस धीरे जब तक छोड़ दिया है पिछले एक छोटे से बर्फ क्रिस्टल मिलाते और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (1 मिलीलीटर) के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण के द्वारा. धीरे कमरे के तापमान 1 मिलीलीटर के साथ बंद शीशी से शेष कोशिकाओं कुल्ला 2% FBS / IMDM और इसे जोड़ने के 50 मिलीलीटर ट्यूब ड्रॉप बुद्धिमान जबकि धीरे घूमता है. 3 मिनट के लिए रुको. अगला, धीरे धीरे 2% FBS / IMDM 2 मिलीलीटर जोड़ने, जबकि धीरे मिश्रण है, और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. 2% जोड़ने FBS / IMDM कि पतला सेल निलंबन के रूप में 3 मिनट के अंतराल पर एक ही मात्रा है, परिवर्धन के बीच में धीरे घूमता है, जब तक अंतिम मात्रा 32 मिलीलीटर तक पहुँच द्वारा कार्यविधि को दोहराएँ.
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र और आसपास 0.5 मिलीलीटर पीछे छोड़ने सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- 20 मिली 2% FBS / IMDM में निलंबित है और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 200 XG पर centrifuging द्वारा गोली धो लें.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और पूरा IMDM माध्यम से लगभग 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं को निलंबित. एक microtube मिश्रण में Trypan नीले समाधान का एक ही मात्रा (0.4%) के साथ सेल निलंबन के 10 μl और ले लो एक hemocytometer का उपयोग गिनती.
- 0.1-.15 X 10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं को पूरा IMDM साइटोकिन्स के साथ पूरक मध्यम जोड़कर पतला (1.3 देखें )
- संस्कृति 2 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं .
पूर्व लोड हो रहा है वायरस द्वारा रेट्रोवायरल transduction
- पारगमन के दिन पर, कुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए तैयार हो preloading वायरस शुरू से पहले कोशिकाओं गिनती.
- Retronectin शेयर 25 μg / मिलीलीटर समाधान पतला और 24 अच्छी तरह से गैर इलाज ऊतक संस्कृति की थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से 400 μl जोड़ने. लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा पूर्व कोट करने के लिए हुड में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
- Retronectin समाधान निकालें और एक अच्छी तरह से डी पीबीएस में 2% BSA के 400 μl जोड़ने. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- वायरस शेयर समाधान पहले गला लें, और बर्फ पर रख. BSA समाधान निकालें, एक अच्छी तरह से वायरस की तैयारी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने, और 2200 XG में 4 पर अपकेंद्रित्र ° सी 15 मिनट के लिए.
- कुओं से वायरस समाधान निकालें और वायरस 2.10 तीन और बार में वर्णित लोड हो रहा है दोहराएँ.
- ठंड 0.5 मिलीलीटर (+ Ca और मिलीग्राम) HBSS या IMDM के साथ एक अच्छी तरह कुल्ला.
- कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 200 XG centrifuging पूर्व सक्रिय CD34 + कोशिकाओं को ले लीजिए.
- 0.1-0.15 x 10 साइटोकिन्स के साथ पूरा IMDM मध्यम में 1.5 मिलीलीटर प्रति 6 कोशिकाओं में कोशिकाओं Resuspend.
- एक अच्छी तरह से 1.5 मिलीलीटर सेल निलंबन जोड़ें और 2 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं .
सेल छँटाई और संग्रह की कोशिकाओं transduced
- धीरे, लेकिन अच्छी तरह से ऊपर वायरस लोड थाली में कोशिकाओं निलंबितऔर एक चोटीदार ट्यूब में 50 सुक्ष्ममापी CellTrics सेल फिल्टर के माध्यम से फिल्टर. Trypan नीले समाधान के एक समान मात्रा के साथ एक microtube मिश्रण में सेल निलंबन के 10 μl ले लो और एक hemocytometer का उपयोग गिनती. ठंड 0.02% EDTA / HBSS (Ca और phenol लाल बिना मिलीग्राम मुक्त) के 0.8 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह कुल्ला और एक 50 सुक्ष्ममापी CellTrics सेल फिल्टर के माध्यम से एक ही संग्रह ट्यूब को जोड़ने.
- 4 में 8 मिनट ° सी के लिए 200 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और 4 में 8 मिनट के लिए 200 XG centrifuging द्वारा गोली (Ca और phenol लाल बिना मिलीग्राम मुक्त) के साथ ठंड HBSS धोने डिग्री सेल्सियस
- 1% BSA / HBSS (Ca और phenol लाल बिना मिलीग्राम मुक्त) 15 एक्स 10 6 मिलीग्राम / या सेल छँटाई के लिए 0.250 मिलीग्राम की एक न्यूनतम मात्रा के एक एकाग्रता में गोली Resuspend . कोशिकाओं को अंधेरे में बर्फ पर रखें. एक ठंड 20% FBS IMDM / / / Glutamine पुनश्च सॉर्ट किया गया कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए मध्यम युक्त ट्यूब तैयार. छंटनी एल्विन जे MoFlo सॉर्टर उच्च गति (Dako, Glostrup, डेनमार्क) का उपयोग चिकित्सा के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल में Siteman कैंसर केंद्र के हाई स्पीड सेल सॉर्टर कोर पर किया जाता है.
सीएफसी परख
- सीएफसी परख मीडिया के 3 मिलीलीटर aliquots के अपेक्षित संख्या पहले गला लें. भंवर सख्ती मिश्रण और ट्यूबों किसी भी बुलबुले कोशिकाओं को जोड़ने से पहले सतह को जन्म वर्तमान कम से कम 5 मिनट खड़े.
- सॉर्ट किया गया प्रत्येक नमूना के लिए सेल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, सेल अनुमानित सेल निलंबन मात्रा द्वारा छँटाई सुविधा द्वारा प्रदान की संख्या को विभाजित. ३,००० लो वायरस transduced, एक बाँझ ठंड 2% FBS / IMDM युक्त microtube में हल कोशिकाओं. पूर्व समायोजित 2% की मात्रा FBS / IMDM इतनी है कि अंतिम निलंबन की मात्रा लगभग 0.3 मिलीलीटर हो जाएगा.
- कोशिकाओं को निरस्त करने और Methocult + GF H4435, जो 1% methylcellulose होते है 30% FBS, 1% BSA, 10 -4 2 mercaptoethanol एम, 2 मिमी एल glutamine के 3 मिलीलीटर विभाज्य पूरे 0.3 मिलीलीटर सेल निलंबन हस्तांतरण , 50 एनजी / एमएल SCF, 20 एनजी / एमएल जीएम-CSF, 20 एनजी / एमएल आईएल 3, 20 एनजी / एमएल आईएल-6, 20 एनजी / जी CSF मिलीलीटर, और 3 इकाइयों / IMDM में मिलीलीटर erythropoietin. मानव methylcellulose समृद्ध मीडिया (आर एंड डी सिस्टम) है, जो 1.3% methylcellulose के होते हैं 25% FBS, BSA% 1, 5 x 10 -5 एम 2 - mercaptoethanol, 2 मिमी एल glutamine, 50 एनजी / मिलीलीटर SCF, 20 एनजी / मिलीलीटर जीएम-CSF, 20 एनजी / एमएल आईएल-3, 20 एनजी / एमएल आईएल-6, 20 एनजी / G-CSF, मिलीलीटर, और 3 इकाइयों / IMDM में मिलीलीटर erythropoietin भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- भंवर सख्ती मिश्रण पूरी तरह से वृद्धि और 3-4 बार गिर बनाने के लिए. चलो ट्यूब 3 मिनट के लिए अभी भी खड़ा है.
- एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक 16 गेज सुई कुंद अंत संलग्न और 2.2 मिलीलीटर आकर्षित. बड़े बुलबुले आकर्षित मत करो, शुरुआत में उन्हें बाहर समय की एक जोड़ी धकेलने के द्वारा निष्कासित. पुश 1.1 मिलीलीटर प्रत्येक दो 30 मिमी पकवान गैर इलाज में और rotating द्वारा मिश्रण समान रूप से फैल.
- एक 100 मिमी की थाली में प्लेटें एक पानी के पकवान युक्त 3 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ मिलकर नकली रखें. संस्कृति के लिए 17 दिन - 14.
- विशेषताएँ और एक संस्कृति एक स्कोरिंग ग्रिड के साथ चिह्नित पकवान में 40x बढ़ाई पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ अपने आकारिकी अनुसार कालोनियों स्कोर. शुद्ध erythroid, myelomonocytic, और मिश्रित: हमारे परख के प्रयोजनों के लिए, कालोनियों 3 श्रेणियों में वर्गीकृत कर रहे हैं. आगे कॉलोनी subclassification के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें.
- पूरे सीएफसी परख थाली बढ़ाई 600 डीपीआई पर एक नियमित रूप से स्कैनर, और (40x) कम बिजली की कालोनियों के photomicrographs एक रंग कैमरा के साथ एक औंधा सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग कर लिया जा सकता है है का उपयोग कर के बिना स्कैन किया जा सकता है.
- भेदभाव और प्रसार के आगे के विश्लेषण के लिए, पूरे सीएफसी परख थाली से कोशिकाओं को कमरे के तापमान 2% FBS / IMDM के कई संस्करणों में निलंबित से बरामद कर रहे हैं. 4 ° C से कम 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation के बाद, कोशिकाओं 2% FBS / IMDM, गिना, और या तो प्रवाह cytometry के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग या Giemsa धुंधला के लिए एक Cytospin अपकेंद्रित्र का उपयोग कर स्लाइड्स को हस्तांतरित में resuspended हैं.
एंटीबॉडी धुंधला हो जाना और प्रवाह cytometry
- 4 में 8 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस और ठंड HBSS में 50% सामान्य माउस सीरम में resuspend (Ca और phenol लाल बिना मिलीग्राम से मुक्त).
- ट्यूब प्रति 80 μl (12 x 75 मिमी ट्यूबों दौर नीचे) में लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं प्लेस और बर्फ पर रख. एंटीबॉडी (लगभग 20 μl मिश्रण या कोई एंटीबॉडी नियंत्रण के लिए नकारात्मक नियंत्रण समाधान) मिश्रण और हल्के ढंग से दोहन ट्यूब द्वारा मिश्रण जोड़ें. कोई एंटीबॉडी के साथ या प्रत्येक fluorochrome के लिए एक विरोधी CD45 एंटीबॉडी के साथ अंशांकन नियंत्रण ट्यूबों तैयार. अंधेरे और 20 मिनट के लिए सेते में बर्फ पर प्लेस ट्यूबों. हल्के से पहले 10 मिनट के बाद ट्यूबों दोहन द्वारा मिक्स. 20 मिनट ऊष्मायन के बाद, ठंड HBSS के साथ ट्यूबों भरने और 4 में 8 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस ठंड 0.5% paraformaldehyde / HBSS में गोली Resuspend.
एंटीबॉडी के निम्न मिश्रण आमतौर पर हमारे विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है. माइलॉयड भेदभाव के लिए: (phycoerythrin संयुग्मित ICRF44 क्लोन) CD11b / CD33 (allophycocyanin संयुग्मित WM53 क्लोन) / CD45 (phycoerythrin - Cy7 - congjugated HI30 क्लोन). Erythroid भेदभाव के लिए: CD71 (phycoerythrin संयुग्मित क्लोन M-A712) / CD235a (allophycocyanin संयुग्मित GA-R2 के क्लोन) / CD45 (phycoerythrin - Cy7 - congjugated HI30 क्लोन). - प्रवाह cytometry उच्च FACScan प्रवाह cytometer 5 रंग और दो लेसरों (बी बायोसाइंसेज) के लिए उन्नत पर स्पीड सेल एल्विन जे मेडिसिन के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल में Siteman कैंसर केंद्र के सॉर्टर कोर पर किया जाता है और CellQuest (बी बायोसाइंसेज) या विश्लेषण का उपयोग कर FlowJO v7.2.4 सॉफ्टवेयर (ट्री स्टार, Inc, Ashland, या, संयुक्त राज्य अमरीका).
Giemsa धुंधला
- लगभग 30,000 सीएफसी परख प्लेटें से बरामद कोशिकाओं ऊपर वर्णित 0.3 में निलंबित कर दिया मिलीलीटर 2% FBS / IMDM और एक कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1000 rpm पर एक Cytospin अपकेंद्रित्र का उपयोग स्लाइड के लिए स्थानांतरित.
- नौ धुंधला निम्नलिखित क्रम में समाधान युक्त जहाजों को निर्धारित करें.
- निरपेक्ष मेथनॉल
- / राइट Giemsa स्टॉक समाधान
- / राइट Giemsa बफर, 6.4 पीएच
- एच 2 हे में 50% मेथनॉल
- एच 2 हे
- एच 2 हे
- फास्फेट बफर, पीएच 6.0
- एच 2 हे
- एच 2 हे
- एक स्लाइड वाहक में स्लाइड प्लेस और निरपेक्ष मेथनॉल में डुबकी (# 1) और 2 मिनट के लिए बंद अतिरिक्त मेथनॉल दाग.
- तत्काल, 5 मिनट के लिए स्लाइड वाहक (# 2) / राइट Giemsa स्टॉक समाधान में डुबकी.
- राइट / Giemsa बफर, 6.4 पीएच (# 3) में वाहक स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- वाहक 50% मेथनॉल में दो बार (# 4) डुबकी, एच 2 (# 5) हे, एच 2 हे (# 6) में एक 10 गुना में 10 बार और फिर फास्फेट बफर, 6.0 पीएच में 5 बार (# 7 ) .
- एच 2 हे (# 8) में वाहक स्थानांतरण और 2 मिनट के लिए सेते हैं. एच 2 हे (# 9) में धोने दोहराएँ.
- स्लाइड्स शुष्क हवा कैरियर में पूरी तरह से दें. प्रत्येक स्लाइड निकालें और दाग को दूर करने के लिए मेथनॉल लथपथ Kimwipes के साथ स्लाइड के पीछे मिटा. Cytoseal 60 की एक बूंद और एक कवर गिलास मुहर रखें.
- एक अंतर 500 सेल गिनती प्रत्येक Giemsa से सना हुआ एक ओलिंप BX51 माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइड के लिए किया जाता है. कक्ष पांच श्रेणियों में विभाजित हैं: आदिम कोशिकाओं विस्फोटों और promyelocytes शामिल हैं, मध्यवर्ती माइलॉयड कोशिकाओं myelocytes और metamyelocytes शामिल हैं, परिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं बैंड, खंडों neutrophils, monocytes, और मैक्रोफेज शामिल हैं, मध्यवर्ती erythroid कोशिकाओं मध्यवर्ती hemoglobinization के साथ कोशिकाओं में शामिल हैं; और परिपक्व erythroid कोशिकाओं में शामिल पूर्ण hemoglobinization के साथ कोशिकाओं. Photomicrographs एक 60x तेल उद्देश्य के साथ एक ओलिंप DP71 कैमरा के साथ लिया जाता है.
3.0) प्रतिनिधि परिणामों:
- सीएफसी परख: इनपुट सेल की आबादी का कुछ पैदा करना, अंतर होगा, और अर्द्ध ठोस मध्यम पर ऊष्मायन 14-17 दिन की अवधि के दौरान फार्म कालोनियों . इस प्रयोग में, यह स्पष्ट है कि NUP98 - HOXA9 ओंकोजीन की अभिव्यक्ति प्रमुख लाल (erythroid कालोनियों) (चित्रा 1) (3) के गठन के कारण होता है.
- एंटीबॉडी धुंधला और प्रवाह cytometry: सीएफसी परख प्लेटें से एकत्र की कोशिकाओं के प्रवाह cytometric immunophenotyping सेल की आबादी का भेदभाव राज्य पर जानकारी प्रदान करता है. कुछ भेदभाव मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के संयुक्त उपयोग करके, और कोशिकाओं की परिपक्वता के वंश की डिग्री मूल्यांकन किया जा सकता है. इस मामले में CD235a erythroid कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. 2A चित्र में दिखाया गया है, NUP98 - HOXA9 CD235a + erythroid कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि के कारण होता है, लेकिन इन कोशिकाओं द्वारा CD235a अभिव्यक्ति की चमक नियंत्रण की तुलना में कम था, erythroid परिपक्वता के निषेध का संकेत है. चित्रा 2B, माइलॉयड कोशिकाओं उनके CD33 धनात्मकता की पुण्य से पहचाने जाते हैं. NUP98 HOXA9 CD11b अभिव्यक्ति की चमक में कमी, माइलॉयड परिपक्वता (3) के निषेध के साथ संगत के साथ CD33 + कोशिकाओं की संख्या में कमी के कारण होता है. इस प्रकार प्रवाह cytometry परिणामों चलता है कि NUP98 - HOXA9 दोनों माइलॉयड और erythroid परिपक्वता के निषेध के साथ एक erythroid hyperplasia के कारण.
- Giemsa धुंधला: सीएफसी परख प्लेटें से एकत्र कोशिकाओं के morphological परीक्षा वंश और सेल की आबादी का परिपक्वता की डिग्री पर जानकारी प्रदान करता है. आकृति विज्ञान से प्राप्त निष्कर्ष प्रवाह cytometric अध्ययनों द्वारा प्राप्त उन लोगों से अलग हो सकता है, और इस प्रकार इन तरीकों एक दूसरे को (3) के लिए पूरक हैं. प्रयोग कम से कम 3 बार दोहराया है, और हर बार एक अंतर 500 सेल गिनती करने के लिए कक्षों की 5 श्रेणियों भेद किया जाता है ऊपर वर्णित के रूप में. इन कोशिकाओं के उदाहरण से बाहर चित्रा 3 में बताया जाता है. परिणाम सारणीबद्ध रहे हैं और विश्लेषण के क्रम में निर्धारित करने के लिए कि क्या वहाँ के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर ओंकोजीन transduced नमूना और नियंत्रण कर रहे हैं. इस मामले में, परिणाम से पता चला है कि NUP98 - HOXA9 संख्या में एक समग्र वृद्धि के कारण होता हैकक्षों की erythroid hyperplasia और दोनों erythroid और माइलॉयड परिपक्वता (3) () नहीं दिखाया के निषेध के साथ, एस.
चित्रा किंवदंतियों
चित्रा 1: मानव सीएफसी आकारिकी पर NUP98 - HOXA9 के प्रभाव.
या तो नियंत्रण MSCV IRES - GFP वेक्टर या सदिश NUP98 HOXA9 व्यक्त के साथ प्राथमिक मानव CD34 + कोशिकाओं retrovirally transduced थे, और कोशिकाओं GFP धनात्मकता के लिए हल किया गया. सीएफसी परख के लिए दो डुप्लिकेट प्लेटों के प्रत्येक में एक हजार कोशिकाओं वरीयता प्राप्त थे और प्रयोग 3 4 स्वतंत्र बार दोहराया गया था. प्रतिनिधि बढ़ाई (बाएं) और प्रतिनिधि erythroid कालोनियों (दाएं) के कम बिजली photomicrographs बिना प्लेट (3) दिखाए जाते हैं.
चित्रा 2: प्रवाह cytometry NUP98 - HOXA9 द्वारा मानव प्राथमिक + सेल भेदभाव CD34 के व्यवधान से पता चलता है.
(ए) erythroid भेदभाव के लिए प्रवाह cytometry: सीएफसी प्लेटों से कक्ष (चित्रा 1 देखें) और काटा गया दाग CD45 और CD235a एंटीबॉडी के साथ. गेट + CD235a एक हिस्टोग्राम (सही पैनल पर) प्लॉट CD235a की अभिव्यक्ति नियंत्रण कक्ष के सापेक्ष दिखाने (बी) के लिए प्रवाह cytometry माइलॉयड भेदभाव: सीएफसी प्लेटों से कक्ष काटा और CD45 और CD33 के साथ दाग थे. + CD33 गेट हिस्टोग्राम पर प्लॉट किए जाते CD11b अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए (सही पैनल) की तुलना में दिखाने के. प्रत्येक फाटक के भीतर गिरने की कोशिकाओं के प्रतिशत (3) दिखाए जाते हैं.
चित्रा 3: सेल आकारिकी से पता चलता है कि वेक्टर नियंत्रण की तुलना में भेदभाव का NUP98 HOXA9 द्वारा व्यवधान.
Cytospin स्मीयरों सीएफसी प्लेटों से तैयार थे और Giemsa साथ दाग. Photomicrographs एक 60x तेल उद्देश्य के साथ प्रतिनिधि क्षेत्रों से ले जाया गया. बी: विस्फोट, एम.एम.: परिपक्व माइलॉयड, आईएम: मध्यवर्ती माइलॉयड, ME: परिपक्व erythroid, IE: मध्यवर्ती erythroid (3).
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Discussion
सीएफसी परख बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है hematopoietic progenitors के प्रसार और भेदभाव पैटर्न को निर्धारित करने के लिए और ओंकोजीन के प्रभाव (4, 5) का अध्ययन. यह एक clonal परख, ऐसी है कि कालोनियों एक एकल पूर्वज के वंशज का प्रतिनिधित्व करते हैं और व्यक्तिगत रूप से आगे के विश्लेषण के लिए हटाया जा सकता है है किया जा रहा है के तरल संस्कृतियों से अधिक लाभ है. सीएफसी परख की सीमा है कि यह अधिक अपरिपक्व progenitors या hematopoietic स्टेम सेल का पता लगाने के के लिए पर्याप्त नहीं है, ऐसी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए पता चला रहे हैं दीर्घकालिक संस्कृति की शुरुआत सेल (एलटीसी आईसी) परख (6, 7). यहाँ वर्णित प्रयोगों दिखाना है कि एएमएल जुड़े ओंकोजीन NUP98 HOXA9 माइलॉयड और erythroid परिपक्वता को रोकता है और erythroid hyperplasia (1, 3) का कारण बनता है.
चूंकि methylcellulose - आधारित संस्कृति अपेक्षाकृत लंबी अवधि है और सीएफसी मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं शामिल नहीं करता है है, यह सर्वोच्च महत्व का है सेल संस्कृतियों के संदूषण, को रोकने के दौरान विशेष रूप से और छँटाई के बाद. थोड़ी सी बैक्टीरियल या फंगल संदूषण संस्कृति डूब जाएगा. प्रवाह cytometry और सेल आकारिकी की व्याख्या अनुभव की आवश्यकता है, प्रशिक्षित कर्मियों के साथ परामर्श की सिफारिश की है. केवल FBS किया गया है कि पूर्व प्राथमिक मानव माइलॉयड progenitors के साथ उपयोग करने के लिए उपयुक्तता के लिए जांच में इस्तेमाल किया जाना चाहिए है, उत्पाद है कि हम नियमित उपयोग अभिकर्मकों तालिका में सूचीबद्ध है. Methylcellulose आधारित सीएफसी मीडिया बहुत चिपचिपा रहे हैं और विशेष देखभाल करते हुए उन्हें समान रूप से मिश्रण करने के लिए और प्लेटों में डालने के लिये से पहले बुलबुले को खत्म करने से निपटने के लिया जाना चाहिए. एक बड़ी थाली में सीएफसी प्लेटों के साथ एक पानी के पकवान शामिल सीएफसी माध्यम से लंबे समय तक ऊष्मायन के दौरान सुखाने को रोकने के महत्वपूर्ण है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उच्च गति सेल सॉर्टर कोर, जो प्रवाह cytometry उपकरण और सेवाओं छँटाई प्रदान का उपयोग के लिए चिकित्सा और सेंट लुइस, MO में बार्न्स यहूदी अस्पताल के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल में एल्विन जे Siteman कैंसर केंद्र, धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों HL082549 R01 और HL084179 K02 (NRY) द्वारा समर्थित किया गया. Siteman कैंसर केंद्र के हिस्से में एक NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान CA91842 p30 द्वारा समर्थित है.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 ligand | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| Human Methylcellulose Enriched Media | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/ Giemsa stain | Harleco | 64571 | |
| Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| Normal Mouse Serum | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555388 | |
| Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551378 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated | BD Biosciences | 555537 | |
| Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated | BD Biosciences | 551336 | |
| Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-well non-treated tissue culture plates | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm non-treated dish | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Gridded scoring dishes | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Biosciences | 35-2070 | |
| Syringes 3 ml | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 gauge blunt-end, 1½ inch needle | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics cell filter | Partec | 04-004-2327 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX sample chambers | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon filter cards | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon cytospin slide holder | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm filter paper | VWR international | 28307-134 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Diaphot | |
| Microscope camera | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
| Microscope camera | Olympus Corporation | DP71 | |
| Scanner | Microtek | Scanmaker 4 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC | |
| Cytospin | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| Bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810-R | |
| Water purification system | Barnstead | Nanopure-Diamond |
References
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif. Leukemia. , Forthcoming (2010).
- Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9. PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).
- Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).
- Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. Hematopoietic colony-forming cell assays. Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).
- Coulombel, L. Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays. Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).
- Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 88, 3765-3773 (1996).
