Protokoll för Dengue Infektioner i Myggor (A. aegypti) och infektion Fenotyp Fastställande

Summary

När en gen har identifierats som potentiellt eldfasta för denguefeber virus, måste det utvärderas för sin roll för att förebygga virusinfektioner inom mygga. Detta protokoll visar hur omfattningen av denguefeber infektioner av myggor kan analyseras. De tekniker för att odla fram viruset i kulturen, membran utfodring myggor blod, och testmetoder för virus titer i myggans midgut demonstreras.

Abstract

Syftet med detta förfarande är att infektera Aedes mygga med denguefeber virus i ett laboratorium skick och undersöka infektionen nivån och dynamiska av viruset i mygga vävnader. Detta protokoll används rutinmässigt för att studera mygga-virus interaktioner, särskilt för identifiering av faktorer roman värd som skall kunna avgöra vektor kompetens. Hela experimentet måste utföras i en BSL2 laboratorium. I likhet med Plasmodium falciparum infektioner, måste korrekt klädsel, inklusive handskar och laboratorierock användas vid alla tillfällen. Efter experimentet, allt material som kom i kontakt med viruset måste behandlas med 75% etanol och blekt innan du fortsätter med vanlig tvätt. Alla andra material måste autoklaveras innan kasta dem.

Protocol

A. Sprid viruset i C6/36 cellinje.

1. Celler växer till 80% confluency i 75 cm ² kolv;
2. Ta bort materialet med 3-4 ml kvar i flaskan;
3. Ta 0,5 virus ml lager och lägga in ovanstående cell med den mångfald av infektion på 1,5 viruspartiklar per cell. Skaka kolven i 15 minuter långsamt vid rumstemperatur.
4. Inkubera 45 minuter vid 5% CO ₂ och 37 ° C
5. Tillsätt 30 ml media och inkubera i 5 dagar.

B. Förbered blandning av virus och blod

1. Lossa cellen med skrapan och överföra cellen och media till 50 ml koniska rör;
2. Centrifugat vid 800 gi 10 minuter, samla in supernatanten, men lämna 1 ml av supernatanten med cellpelleten;
3. Frys ovanstående cellpelleten i torr CO ₂ och sedan tina i 37 ° C vattenbad, upprepa två till tre gånger;
4. Centrifugat vid 800 gi 10 minuter, ta supernatanten, och kombinera med supernatanten samlas in från steg 3;
5. Samla helblod med samma förfarande (steg 3) för beredning av gametocyte kultur att infektera Anopheles mygga med Plasmodium falciparum,
6. Kombinera lika mycket av ovanstående helblod med virus supernatanten från steg 4, och lägg humant serum (10% av hela volymen).
7. Inkubera ovanstående blandning av humanblod och denguefeber virus i 30 minuter vid 37 ° C vattenbad

C. Utfodring myggor

Detta förfarande är nästan identiskt med vad som har beskrivits i avsnittet för Plasmodium falciparum infektioner i myggor. Vi Analysera midgut infektion vid dag 7 och saliv infektion vid dag 14 efter blod-matning. Allt material som kom i kontakt med viruset behandlas först med 75% etanol och därefter med 10% blekmedel.

D. Analysera viruset titer i mygga vävnad

1. Två eller tre dagar innan dissekering av mygga vävnad, växer C6/36 cell i en 24 brunnar så att cellen når 80% confluency på den dag då analysen sker;
2. Myggor bedövas vid 4 ° C, offrade och ytbehandlade sterila genom att blötlägga dem i 75% etanol i 1 minut. Sedan mygg spolades med sterilt vatten två gånger innan dissekering av midgut eller salivkörtlarna under dissekera mikroskop. Från detta steg, behöver all proceduren nedan för att föras i en steril miljö som en biologisk säkerhet skåp. Dessa vävnader överförs till ett rör som innehåller 150 l media och homogeniseras med en Kontes pellets mortelstöt motor för 90 sekunder;
3. Gör en 1:100 utspädning genom att tillsätta 10 ìl av homogenatet till 990 l medier;
4. Gör ytterligare 1: 10, 1:100 och 1:1000 spädning med mediet i 96 brunnar;
5. Ta bort materialet i 24 brunnar, och tillsätt 100 l av varje av ovanstående fyra utspädning för att varje motsvarande väl;
6. Skaka plattan sakta i 15 minuter vid rumstemperatur, sedan inkubera 45 minuter vid 5% CO ₂ och 37 ° C;
7. Tillsätt 1 ml methycellulose overlay (1%) i varje brunn;
8. Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO ₂ i 5 dagar;
9. Stegen härifrån om inte kräver en steril miljö men som med alla andra patogen försiktighet bör iakttas vid alla tillfällen. Kasta methycellulose overlay från varje tallrik och blot för att avlägsna överskott medier
10. Tillsätt 1 ml metanol / aceton fixativ (1:1) i varje brunn. Förvara vid 4 ° C under 1 timme;
11. Häll av fixativ och tvätta en gång med 1X PBS;
12. Gör 1:1000 spädning för den primära antikroppen mot viruset med 5% ASFULL;
13. Tillsätt 200 l utspädd hyperimmunserum vätska till varje brunn, inkubera vid 37 ° C under 1 timme;
14. Ta bort hyperimmunserum vätska och tvätta plattan med 1 X PBS
15. Förbered en 1:1000 spädning av get-anti-mus-konjugat (KPL Cat # 074-1806) i 5% ASFULL (5g pulver skumma mjölk i 100 ml 1 X PBS), och lägg sedan till 200 l till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 1 timme;
16. Förbered underlaget på följande sätt: tillsätt 1 tablett 3'-Diaminobenzidin terrahydrochloride (Sigma Katt # D5905) i 20 ml 1 X PBS, efter upplöst, och sedan lägga till 8 l av 30% väte peroxidas
17. Tillsätt 200 l av ovanstående substrat till varje brunn. Låt stå i rumstemperatur i 10 minuter
18. Ta bort substrat och stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 ml destillerat vatten i varje brunn
19. Häll bort vatten och torka plattorna torka
20. Räkna viruspartikeln

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito