Подготовке высококвалифицированных Связанные сердце крысы Митохондрии

Summary

Мы описываем а протокол для выделения чистых, высоко связанной сердце крысы митохондрий для функциональных или структурных исследований клеточной биоэнергетики, биофизических измерений, протеомики и митохондриальной ДНК и липидов анализа.

Abstract

Функция митохондрий в поколение сотовой АТФ в процессе окислительного фосфорилирования широко признается. В течение последнего десятилетия были достигнуты значительные успехи в нашем понимании функции митохондрий, кроме извлечения энергии. К ним относятся их роль в апоптозе, выступая в качестве сигнализации органелл, млекопитающих, развития и старения, а также их вклад в координацию между клеточного метаболизма и пролиферации клеток. Наше понимание биологических процессов модулируется митохондрий основана на надежных методов выделения и обработки интактных митохондрий из тканей лабораторных животных. Митохондрии из сердца крысы является одним из наиболее распространенных подготовке к прошлому и современные исследования клеточного метаболизма в том числе исследования по нокаут животных.

Здесь мы опишем подробную быстрый метод выделения интактных митохондрий с высокой степенью сцепления. Такая подготовка сердце крысы митохондрий является прекрасным объектом для функциональных и структурных исследований на клеточном биоэнергетика, транспорта биомолекул, протеомных исследований и анализа митохондриальной ДНК, белки и липиды.

Protocol

Введение

Митохондрии из сердца крысы является одним из наиболее распространенных подготовке к прошлому и современные исследования клеточного метаболизма. Они могут быть получены быстро и надежно в большом количестве от дикого типа или нокаут животных. Общая процедура состоит из ткани пищеварения трипсином, фракционирования и дифференциального центрифугирования.

Есть несколько условий, которые должны храниться в течение Выделение митохондрий из различных тканей, в том числе сердца (рис. 1).

• Ткань должна быть тщательно фарш, так как это напрямую влияет на урожайность получена митохондрий. Сердце ткани лучше фарш с небольшим изогнутые ножницы и может сопровождаться использованием Latapie мясорубку ткани, или, если ткань мясорубку недоступен, чеснок пресса с выходом отверстия диаметром около 1,0 мм в диаметре.
• Это необходимо для поддержания температуры решений на каждом этапе. Поэтому вся процедура должна быть проведена в холодной комнате и все инструменты и решения должны быть подготовлены и охлаждение заранее. Если температурные условия не сохраняются стабильные несколько свойств препарата может быть потеряна. Митохондриальная структура очень чувствительны к замораживанию так overfreezing суспензии (например, во время центрифугирования) не допускается, особенно если исследования активного транспорта имеют важное значение.
• Важным параметром является временной продолжительности процедуры, изоляция должна быть выполнена как можно быстрее, и полученный препарат должен быть использован немедленно. Таким образом, хирургические инструменты, растворы и приборы должны быть подготовлены заранее.

Материалы и инструменты

Инструменты

1. Прямые операционные ножницами, острием
2. Изогнутые ножницы
3. Щипцы
4. Чашка Петри
5. Малый воронка + кусок нейлоновый фильтр (prewashed)
6. 6 стаканов 50 мл
7. Два магнитных мешалок и две бани льда
8. Один большой ледяной бане
9. 2 маленьких магнитных баров
10. Шпатели для гранул выскабливание
11. Пробирки центрифужные
12. Latapie ткани прессы (можно заменить чеснок пресса)
13. Тефлон-стекло гомогенизаторов 20 мл и 1-2мл
14. Отходы стакан
15. Эппендорф труб для окончательного митохондриальной суспензии и проб для определения белка
16. Лед ванны

Решения (в расчете на 2 крыс):

1. Стиральная буфера: 0,3 М сахарозы, 10 мМ HEPES (рН = 7,2), 0,2 мМ ЭДТА (1000 мл)
2. Изоляция буфера: 0,3 М сахарозы, 10 мМ HEPES (рН = 7,4), 0,2 мМ ЭДТА, 1 мг / мл BSA (Sigma A6003) (100 мл готовят из Стиральная буфера). Бычий сывороточный альбумин можно заменить на менее дорогие жирные кислоты, свободных аналогов. Этот же буфер или его изотонический вариации могут быть использованы в качестве ресуспендированием буфера.
3. Трипсина (Sigma T8003) решение: 2.5mg/ml в 1 мМ HCl (0,5 мл)
4. Ингибитор трипсина из соевых бобов (Sigma T9128) 6.5 мг/10 мл буфера Изоляция

Протокол

Общая схема процедуры показан на рис. 1. Сердца должен быть охлажден и мыть в стиральной буфера, желудочковой ткани вырезают, фарш и гомогенизируют в течение фотолитического лечения трипсином. Суспензию центрифугируют при низкой скорости и получить супернатант центрифугируют снова на более высокой скорости для сбора митохондрий. В зависимости от планируемых экспериментах ресуспендированием буфер может быть заменен любым другим изотонический раствор.

Животные были прекращены в соответствии с Великобританией "Животные (Научно процедуры) Закона." цервикальным сдвигом с последующей путем обезглавливания. Необходимо извлечь сердце сразу после обезглавливания животного, так что нет никакой задержки между прекращением животных и сердце добычи. Если параллельные изоляции митохондрий печени, как ожидается, крысы должны быть постился всю ночь до эксперимента.

1. Подготовка три стакана, содержащего 40 мл промывочного буфера. Прохладный их в лед-солевой бане в течение 3 до 5 мин, прежде чем переходить к следующему шагу. Убедитесь, что не overfreeze их и использовать сразу же после облака из кристаллов льда начинают появляться.
2. Открытое грудной клетки обезглавленное крысы и извлечь сердце. Сделать небольшие надрезы, а затем немедленно передать сердце ледяной решение в первый стакан. Сожмите сердце, чтобы удалить кровь и положил его во второй стакан. Повторите эту операцию для каждого сердца.
3. Сухой сердца на фильтровальную бумагу. Удалите весь жир, со сгустками крови, ушных раковин и фасции и бассейн желудочковой ткани.
4. Фарш объединенные ткани с небольшими изогнутыми ножницами на чашке Петри на льду в течение около 5 минут, пока размер частиц составляет около 1-2 мм.
5. Положить фарш ткани в ткань прессы и передатьего до конца. Имейте в виду, что значительное количество материала может оставаться в пресс поэтому собрать все ткани сердца от стенок и дна прессы.
6. Передача материалов в стакан с 50 мл буфера стиральные и перемешать. Затем процедить суспензии через нейлоновый фильтр. Вымойте измельченной ткани на фильтре 3 раза промывочного буфера и отбросить фильтрата.
7. Передача мыть ткани в 20 мл промывочного буфера и поместите его в ледяной бане на магнитной мешалкой. Добавить 0,5 мл раствора трипсина при постоянном перемешивании и запустить таймер. Подготовка другой магнитной мешалкой, ледяную ванну и второй 50 мл стакан.
8. На ^4-й минуте кратко получения однородной массы подвески часть на части с помощью небольшого слабо оснащены стеклянными тефлоновым гомогенизатора (10-15мл) с несколькими вверх и вниз, чтобы разогнать ударов подвески. После гомогенизации передачи подвески во второй стакан. Повторите процедуру на ^9-й минуте, так что вы выполняете гомогенизации суспензии два раза в общей сложности. После 15 мин инкубации, добавляют 10 мл выделения буфера, содержащего ингибитор трипсина и инкубировать в течение 1 мин.
9. Фильтры подвески опять же через нейлоновый фильтр и сохранить фильтрата. Сбор фракция частиц остается на фильтре и гомогенизации в течение 1 мин в 15-20 мл промывочного буфера.
10. Комбинат гомогената с фильтрат и центрифуги в течение 15 минут при температуре 600 гр.
11. Тщательно фильтр Полученный супернатант в новую пробирку центрифуги. Избегайте загрязнения гранул и центрифуга снова в течение 15 мин при 8500g.
12. После окончания средней скорости центрифугирования супернатант отказаться и ополосните гранулы 2-3 раза с 1 мл буфера отбрасывая пушистый белый наружный слой обода. Разбейте гранул с лопаточкой, но избежать красное пятно эритроцитов на дне. Если клетки крови получили Лоос, удалить красные биты от подвески до гомогенизации.
13. Ресуспендируют гранул с небольшим гомогенизатора или, наоборот, осторожно пипеткой. Развести подвеска с более Isolationbuffer и центрифуга снова в течение 15 мин при 8500g.
14. Удалите надосадочную, ресуспендируют осадок в ресуспендированием Buffer (изотонический буферный выбора), и центрифуга снова.
15. В результате коричневые гранулы содержит мыть интактных митохондриях. Ресуспендируют пеллет в очень малом объеме изотонического буфера на ваш выбор.

Рисунок 1. Схема демонстрирует пошаговая процедура выделения сердце крысы митохондрий. Верхняя часть, этапы 1-9: ткани нарушения, трипсина лечения и гомогенизации; нижней части, этапы 10-15: дифференциального центрифугирования.

Discussion

Подробная быстрым протоколом для изоляции интактных митохондрий с высокой степенью сцепления описана. Полученный препарат может быть использован для функциональные или структурные исследования на клеточном биоэнергетика, протеомных исследований или анализа митохондриальной ДНК и липидов. Биофизические исследования активный транспорт ионов и метаболических промежуточных также может быть выполнена. Вполне возможно, для дальнейшей обработки митохондриальных подготовки, чтобы изолировать СМЧ, наружной мембраны или очистки отдельных компонентов окислительного фосфорилирования. Описанный метод является модификацией стандартного протокола изоляции Якоб и Сакс ^1. Ожидаемый выход подготовленной митохондрий составляет около 10-15 мг митохондриального белка на сердце и дыхательный коэффициент на малат / глутамат такого препарата колеблется от 8 до 12 с Государственным IV дыхания около 0,12 мкмоль O ₂ Xmin белка ^-1 xmg ^-1 при 23 ° С в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 10 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ фосфата калия (рН 8,0) с 150 мкМ АДФ для возбуждения дыхания государства III (для точных экспериментальных условиях и дополнениями, см. . ^2).

Особое внимание следует уделить несколько технических деталей перед запуском выделения. Крайне важно использовать чистые поликарбоната или трубы полипропиленовые центрифуги, поэтому трубы должны быть тщательно промывают чистой щеткой и горячей водой, однако моющее средство лечения должны находиться на минимум. Кроме того, лучше, чтобы собрать все необходимые посуды и приборов в холодильной камере за день до изоляции.

Во время изоляции при передаче буферов из колб для стаканов, а особое внимание должно быть уделено предотвращению каплями ледяной воды в растворах. При обработке тканей следует подчеркнуть, что сердце добыча должна проводиться как можно скорее, так как даже кратковременная задержка между обезглавливание животных и охлаждение тканей может привести к частичной несвязанных митохондрий. Быстрое охлаждение и тщательное мытье удалены сердца имеет важное значение для получения стандартного препарата, свободные от гемоглобина и эритроцитов NADase.

Трипсин применяется для соединительной деградации белков повышают восприимчивость тканей к поперечной силы при гомогенизации. Длительное воздействие на ткани протеазы следует избегать, поскольку она приводит в митохондриях низкого качества.

После окончания средней скорости центрифугирования стены центрифужные пробирки следует протереть салфеткой, чтобы удалить жировые отложения материала, накопленного на стенах.

Для окончательного ресуспендирования лучше использовать низкий объем окончательного буфера для того, чтобы свести к минимуму потери митохондриальной функции в процессе хранения (от 150 до 200 мкл буфера на сердце). Для изучения транспорта двухвалентных катионов не хелатообразователей должны присутствовать в окончательной подготовки таким образом митохондрии следует мыть несколько раз с EGTA среде без и использовать в течение первых часов после изоляции.