Summary
我々は細胞の生体エネルギー、生物物理学的測定、プロテオミクスやミトコンドリアDNAと脂質の分析の機能的または構造的研究のためのミトコンドリア純粋な、高度に結合したラット心臓の分離のためのаのプロトコルについて説明します。
Abstract
酸化的リン酸化の過程で細胞内のATPの世代にミトコンドリアの機能が広く認識されている。過去数十年の間にエネルギーの世代よりもミトコンドリアの他の機能の理解に大きな進歩がありました。これらは、シグナル伝達細胞小器官、哺乳類の開発と高齢化だけでなく、細胞の代謝と細胞増殖の間の調整への貢献として機能する、アポトーシスにおける役割が含まれています。ミトコンドリアで変調された生物学的プロセスの理解が分離し、実験動物の組織から無傷のミトコンドリアの処理のための堅牢な方法に基づいています。ラットの心臓からミトコンドリアは、ノックアウト動物に関する研究を含む細胞代謝の過去と現在の研究のための最も一般的な準備の一つです。
ここでは、結合度の高い無傷ミトコンドリアの単離のための詳細な迅速な方法を説明します。ミトコンドリアラットの心臓のような製剤は、細胞の生体エネルギー、生体分子の輸送、プロテオミクス研究やミトコンドリアDNA、タンパク質や脂質の分析上の機能と構造の研究のための優れたオブジェクトです。
Protocol
はじめ
ラットの心臓からミトコンドリアは細胞代謝の過去と現在の研究のための最も一般的な準備の一つです。彼らは、野生型またはノックアウト動物から大量に迅速かつ確実に得ることができます。一般的な手順は、トリプシン、分画および分画遠心法によって組織の消化で構成されています。
心臓（図1）を含む、様々な組織からミトコンドリアの単離中に保持しなければならないいくつかの条件があります。
- 組織は、それが直接得られるミトコンドリアの収量に影響を及ぼすので徹底的に、みじん切りする必要があります。心臓組織は、小さな曲線ハサミでミンチに最適ですし、組織グラインダーは、1.0前後直径の出口孔径とガーリックプレス利用できない場合は、Latapie組織グラインダーを使用するかを続けることができます。
- それは、各ステップでの解の温度を維持するために必要です。したがって、全体の手順は、寒い部屋とすべての機器で行う必要があるとソリューションは、事前に準備して冷却する必要があります。温度条件が保存されていない場合は準備の安定的ないくつかのプロパティが失われることがあります。ミトコンドリアの構造は、能動輸送の研究が重要な場合は特に、凍結ので、懸濁液のoverfreezing（遠心分離時など）に非常に敏感であることは許可されていません。
- 重要なパラメータは、プロシージャの時間の長さであり、分離は、可能な限り迅速に実施して得られる製剤は直ちに使用する必要がありますする必要があります。したがって、手術器具、ソリューション及びアプライアンスは、事前に準備する必要があります。
材料と器具
楽器
- ストレートオペレーティングはさみ、鋭いポイント
- 湾曲したハサミ
- 鉗子
- ペトリ皿
- 小さな漏斗+ナイロンフィルターの一部（洗ってある）
- 6ビーカー50ミリリットル
- 二つのマグネットスターラー二氷浴
- 一つの大きな氷浴
- 2つの小さな磁石のバー
- 掻きペレット用ヘラ
- 遠心チューブ
- Latapie組織のプレス（ガーリックプレスで置換することができます）
- 20ミリリットルと1〜2ミリリットルテフロン - ガラスのhomogenisers
- 廃棄物のビーカー
- タンパク質測定のための最終的なミトコンドリア懸濁液と試料のエッペンドルフチューブ
- 氷浴
ソリューション（2匹ごとに計算）：
- 洗浄緩衝液：0.3 Mのショ糖、10mMのHEPES（pH値= 7.2）、0.2mMのEDTA（1000 ml）を
- 絶縁バッファ：0.3 Mのショ糖、10mMのHEPES（pH = 7.4）で、0.2mMのEDTA、1 mg / mlのBSA（シグマA6003）（100ミリリットルの洗浄用バッファーから調製）。ウシ血清アルブミンは、より安価な脂肪酸を含まない類縁体で置換することができる。同じバッファまたはその等張バリエーションがバッファを再懸として使用することができます。
- トリプシン（シグマT8003）解決策：1mMのHCl中で2.5mg/ml（0.5 ml）を
- 大豆（シグマT9128）絶縁バッファの6.5 mg/10 mlのトリプシンインヒビター
プロトコル
手順の一般的なスキームを図に示されています。 1。心臓を冷却し、バッファ、心室組織は、摘出したみじん切りとトリプシンとの光分解治療中に均質洗濯で洗浄する必要があります。懸濁液を低速で遠心分離し、得られた上清は、ミトコンドリアを収集するためにより高い速度で再び遠心分離する。計画された実験に応じて再懸濁バッファーは、他の等張液で置き換えることができます。
動物は、英国に基づき終了された"動物（科学的手続）法。"頸椎脱臼によって斬首によって続く。それは、動物の終端と心臓の抽出の間に遅延がないように、すぐに動物の斬首後に心臓を取り出すようにしなければなりません。肝ミトコンドリアのパラレル分離が期待されている場合、ラットは前の実験に一晩絶食されるべきである。
- 洗浄バッファー40mlを備えた三ビーカーを準備します。次の手順に進む前に3〜5分間、氷塩浴でそれらを冷却する。それらをoverfreezeと氷の結晶の雲が現われ始める直後にすぐに使用しないことを確認してください。
- 首を切らラットの胸部を開き、心を抽出する。小さな切開を行い、その後すぐに最初のビーカーに氷冷溶液に心を移す。血液を除去すると第二のビーカーにそれを置くために心を絞る。それぞれの心のためにこの操作を繰り返します。
- ろ紙上に心を乾かします。すべての脂肪、血餅、耳介や筋膜やプール心室組織を削除します。
- 粒子の大きさは1-2 mm程度になるまで約5分間氷上でペトリ皿上で小さな曲面ハサミでプールされた組織をミンチ。
- 組織のプレスとパスにみじん切りの組織を置くそれを通して。材料のかなりの量が非常にマスコミの壁や底部からすべての心臓組織を収集する記者に残ることがあるので注意してください。
- 50 mlの洗浄バッファーをビーカーに材料を移し、かき混ぜる。その後、ナイロンフィルタを介してサスペンションにフィルタをかける。洗浄バッファーでフィルターを3回にみじん切りの組織を洗浄し、ろ液を捨てる。
- 洗浄緩衝液20ml中に、洗浄した組織を移し、マグネチックスターラー上に氷浴に入れてください。一定速度で撹拌下でトリプシン溶液0.5mlを追加し、タイマーを起動します。別のマグネチックスターラー、氷浴と第50 mlのビーカーを用意します。
- 第 4 回分で簡単にサスペンションを分散させるために最大で数とダウンストロークで小さな遊嵌ガラス-テフロンホモジナイザーを（10〜15ミリリットル）を使用して部分によってサスペンションの部分を均質。均質化した後に第二のビーカーに懸濁液を移す。あなたが全体の中の懸濁液の均質化を2回行うように、 第 9 回分でこの手順を繰り返します。インキュベーションの15分後、バッファを含むトリプシンインヒビターを分離10mlを加え、1分間インキュベートする。
- ナイロンフィルターに通し、再び懸濁物を濾過し、ろ液を保存する。洗浄バッファーの15〜20ミリリットルで1分間フィルタと均質に残された微粒子画分を集める。
- ろ液とのホモジネートを組み合わせると600グラムで15分間遠心操作。
- 慎重に新しい遠心管に得られた上清をフィルターします。ペレットによる汚染を回避し、8500グラムで15分間再遠心する。
- 高速遠心分離後上清を破棄し、バッファを破棄白色綿毛状の外縁層1mlでペレット2〜3回すすいでください。スパチュラでペレットを破るが一番下にある赤血球の赤色スポットを避ける。血液細胞はロースを取得した場合、均質化する前に懸濁液から赤のビットを削除する。
- 穏やかなピペッティングによる小ホモジナイザーあるいはでペレットを再懸濁します。より多くのIsolationbufferで希薄懸濁液と8500グラムで15分間再遠心する。
- 上清を廃棄し、バッファを（任意の等張緩衝液）再懸でペレットを再懸濁し、再び遠心する。
- 得られた茶色のペレットは、洗浄後そのままミトコンドリアが含まれています。お好みの等張緩衝の非常に小さな音量でペレットを再懸濁する。
ミトコンドリアラットの心臓の分離のステップの手順でステップを示す図1。スキーム。上部、ステージ1-9：組織破壊、トリプシン処理し、均質化、底の部分、ステージ10-15：分画遠心法。
Discussion
結合度の高い無傷ミトコンドリアの単離のための詳細な迅速なプロトコルが記述されています。て得られる製剤は、細胞生体エネルギー、プロテオミクス研究やミトコンドリアDNAと脂質含量の分析に機能的または構造的な研究に使用することができます。イオンと代謝中間体の能動輸送の生物物理学的研究も行うことができます。さらに亜ミトコンドリアの粒子、外膜を分離したり、酸化的リン酸化の別個の成分を浄化するために、ミトコンドリアの準備を処理することが可能です。記載された方法はジャコバス、サックス1による分離の標準的なプロトコルの変更です。準備ミトコンドリアの予想収量は、心臓あたりのミトコンドリアタンパク質の約10〜15ミリグラムであり、そのような準備のリンゴ酸/グルタミン酸に対する呼吸調節率は0.12前後モルO 2 xminは-1 XMGのタンパク質の状態IVの呼吸、8〜12の間に変化する23 -1 ° 0.25 Mショ糖を含む培地中でC、10mMの塩化カリウム、0.2mMのEDTA、正確な実験条件および付加のためのイニシエーションの状態IIIの呼吸（150μMADPで5 mMリン酸カリウム（pH8.0）に、refを参照してください2）。
特別な注意が分離手続の開始前にいくつかの技術的な詳細に与えられるべきである。それは、チューブが完全にクリーンなブラシや温水で洗浄する必要があるため、クリーンなポリカーボネートやポリプロピレン遠心チューブを使用することが重要ですが、界面活性剤処理は必要最小限度のものとすべきである。また、それは分離前日寒い部屋に必要なすべてのガラス器具や楽器を収集することをお勧めします。
隔離中にフラスコからビーカーにバッファを転送する際に、а特別な注意は、ソリューションに氷水の低下を防ぐために与えられるべきである。組織を取り扱う際には、心臓の抽出は、動物の斬首と組織を冷却する間にも短い時間遅延は部分的に非結合ミトコンドリアの結果になるので、できるだけ早く実施すべきであることを強調しておきたい。急速冷却と削除された心の徹底的な洗浄は、ヘモグロビンと赤血球NADaseからフリー、標準製剤を得ることが不可欠である。
トリプシンは、均質化中に、せん断力に組織の感受性を高めるために結合するタンパク質の分解に使用されます。それは低品質のミトコンドリアにつながるので、プロテアーゼの組織の長期ばく露は避けるべきである。
高速遠心後の遠心チューブの壁は、壁に蓄積された脂肪物質の付着物を除去するためにティッシュペーパーで拭き取ってください。
最終的な再懸濁するためには、貯蔵中のミトコンドリアの機能（心臓あたりのバッファ150〜200μlの）の損失を最小限に抑えるために、最終的なバッファの低容量を使用することをお勧めします。二価陽イオンの輸送の研究にはキレート剤は、EGTAを含まない培地で数回洗浄し、分離後の最初の時間内で使用されるべきであるため、ミトコンドリア、最終調製物中に存在してはならない。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、ミトコンドリアの生物学の分野への著者の紹介と、この手順では多くの有用な洞察とアドバイスを教授A.ビノグラードフ博士とヴェラGrivennikovaに感謝。著者らは、ビデオの準備のヘルプはクイーンズ大学メディアオフィスからミセスアマンダMcKintockに感謝しています。
References
- Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
- Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).
