Beredning av Mycket Tillsammans Rat hjärta mitokondrier

Summary

Vi beskriver а protokoll för isolering av rena, mycket kopplat råtta hjärta mitokondrier för funktionella eller strukturella studier av cellulära bioenergetik, biofysiska mätningar, proteomik eller mitokondrie-DNA och lipider analys.

Abstract

Mitokondriernas funktion i produktionen av cellulära ATP i processen för oxidativ fosforylering är allmänt erkänt. Under de senaste decennierna har det skett betydande framsteg i vår förståelse av de funktioner mitokondrier än generera energi. Dessa inkluderar deras roll i apoptos, i egenskap av signalering organeller, däggdjur utveckling och åldrande samt deras bidrag till samordningen mellan cellens ämnesomsättning och celltillväxt. Vår förståelse av biologiska processer moduleras av mitokondrier är baserad på robusta metoder för isolering och hantering av intakt mitokondrier från vävnader i försöksdjur. Mitokondrier från råtta hjärta är en av de vanligaste preparat för tidigare och nuvarande studier av cellulär metabolism, inklusive studier på knock-out djur.

Här beskriver vi en detaljerad snabb metod för isolering av intakt mitokondrier med en hög grad av koppling. En sådan beredning av råtta hjärta mitokondrier är ett utmärkt objekt för funktionella och strukturella forskning om cellulära bioenergetik, transport av biomolekyler, proteomik studier och analys av mitokondrie-DNA, proteiner och lipider.

Protocol

Inledning

Mitokondrier från råtta hjärta är en av de vanligaste preparat för tidigare och nuvarande studier av cellulär metabolism. De kan erhållas snabbt och säkert i stor mängd från vilda typ eller knock-out djur. Det allmänna förfarande som består av vävnad matsmältningen genom att trypsin, fraktionering och differentierad centrifugering.

Det finns flera villkor som måste hållas under Isolering av mitokondrier från olika vävnader, däribland hjärtat (Fig. 1).

• Vävnaden måste vara ordentligt malet, eftersom det direkt påverkar avkastningen av erhållna mitokondrier. Hjärtvävnad är bäst att mala med små böjda sax och kan följas med hjälp en Latapie vävnad kvarn eller, om en vävnad kvarnen inte är tillgänglig, en vitlökspress med utlopp hål diameter på ca 1,0 mm i diameter.
• Det är nödvändigt för att hålla temperaturen av lösningar vid varje steg. Därför hela proceduren måste genomföras i ett kallt rum och alla instrument och lösningar måste tas fram och kylas i förväg. Om temperaturen villkoren inte hålls stabilt flera beredningens egenskaper kan gå förlorade. Mitokondriell struktur är mycket känslig för frysning så overfreezing av fjädring (t.ex. under centrifugering) är inte tillåtet, särskilt om studier av aktiv transport är viktiga.
• En viktig parameter är den tid-längden på förfarandet, isolering bör utföras så snabbt som möjligt och de erhållna beredningen måste användas omedelbart. Därför kirurgiska instrument, lösningar och utrustning måste förberedas i förväg.

Material och instrument

Instrument

1. Rak drift sax, vass spets
2. Böjd sax
3. Tång
4. Petriskål
5. Liten tratt + bit av nylon filter (förtvättas)
6. 6 bägare 50 ml
7. Två magnetomrörare och två bad is
8. En stor isbad
9. 2 små magnetskenor
10. Spatlar för pellets skrapning
11. Centrifugrör
12. Latapie vävnad tryck (kan ersättas med vitlökspress)
13. Teflon-glas homogenisatorer 20ml och 1-2ml
14. Avfall bägare
15. Eppendorf-rör för slutlig mitokondrie-fjädring och prover för protein bestämning
16. Ice bad

Lösningar (räknat per 2 råttor):

1. Tvätt buffert: 0,3 M Sackaros, 10 mm HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Isolering buffert: 0,3 M Sackaros, 10 mm HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma A6003) (100ml beredd av tvätt buffert). Bovint serumalbumin kan ersättas med billigare fettsyran utan analoger. Samma buffert eller isoton variationer kan användas som Resuspending buffert.
3. Trypsin (Sigma T8003) lösning: 2.5mg/ml i 1mm HCl (0,5 ml)
4. Trypsininhibitorer från sojabönor (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolering buffert

Protokoll

Den allmänna ordningen för förfarandet visas på bild. 1. Hearts ska kylas och tvättas i tvätt-buffert, ventrikulär vävnad skärs, malet och homogeniserade under fotolytisk behandling med trypsin. Suspensionen är centrifugeras vid låg hastighet och de erhållna supernatanten centrifugeras igen vid högre hastighet för att samla mitokondrier. Beroende på den planerade experiment resuspending buffert kan ersättas av någon annan isoton lösning.

Djur sägs upp i enlighet med den brittiska "Djur (vetenskapliga förfaranden) Act." av halsdislokation följt av halshuggning. Det är nödvändigt att extrahera hjärtat omedelbart efter halshuggningen av djuret, så att det finns ingen fördröjning mellan djur uppsägning och hjärta extraktion. Om parallella isolering av leverns mitokondrier förväntas råttorna ska vara fastande över natten innan experimentet.

1. Förbered tre bägare som innehåller 40 ml tvättbuffert. Kyl dem i is-salt bad i 3 till 5 minuter innan du fortsätter till nästa steg. Se till att inte overfreeze dem och användas omedelbart precis efter moln av iskristaller börjar dyka upp.
2. Öppna bröstkorgen av halshuggen råtta och extrahera hjärtat. Gör små snitt och sedan omedelbart överföra hjärtat till iskalla lösning i den första bägaren. Pressa hjärta att ta bort blod och lägg den i den andra bägaren. Upprepa detta för varje hjärta.
3. Torka hjärtan på filterpapper. Ta bort alla fett, levrat blod, auricles och fasciae in och sammanställa ventrikulära vävnad.
4. Finhacka den poolade vävnaden med liten böjd sax på petriskål på is för ca 5 min tills partiklarnas storlek är ca 1-2 mm.
5. Sätt malet vävnaden i vävnaden tryck och passeraigenom det. Var medveten om att en betydande del av materialet kan finnas kvar i pressen så samla alla hjärtat vävnad från väggar och botten av pressen.
6. Överför materialet i bägaren med 50 ml tvättbuffert och rör om. Sedan filtrera suspensionen genom en nylon filter. Tvätta det malda vävnad på filtret 3 gånger med tvättbuffert och kasta filtratet.
7. Överför tvättade vävnad till 20 ml tvättbuffert och placera den i isbad på magnetomröraren. Tillsätt 0,5 ml trypsin lösning under ständig omrörning och starta timern. Förbered en magnetomrörare, isbad och en andra 50 ml bägare.
8. Den ^{4: e} minuten kortfattat homogenisera suspensionen del av del hjälp av en liten löst påsatt glas-Teflon homogenisator (10-15ml) med flera upp och ner stroke att skingra suspension. Efter homogenisering överför suspensionen i den andra bägaren. Upprepa proceduren på den ^{9: e} minut, så att du utför homogenisering av suspensionen två gånger totalt. Efter 15 min av inkubationen, tillsätt 10 ml isolera buffert innehållande trypsin inhibitor och inkubera i 1 min.
9. Filtrera suspensionen igen genom en nylon filter och spara filtratet. Samla partiklar bråkdel kvar på ett filter och homogenisera under 1 min i 15-20 ml tvättbuffert.
10. Kombinera homogenatet med filtratet och centrifugera i 15 min på 600g.
11. Försiktigt filtrera resultatet supernatanten till ett nytt centrifugrör. Undvik förorening av pellets och centrifugera igen i 15 min vid 8500g.
12. Efter snabb centrifugering kassera supernatanten och skölj pelleten 2-3 gånger med 1 ml av buffert kassera de fluffiga vita yttre kanten lager. Bryt upp pelleten med spateln men undvik de röda fläck av erytrocyter i botten. Om blodkropparna blev Loos, ta bort röda bitar från suspensionen före homogenisering.
13. Suspendera pelleten med en liten homogenisator eller alternativt genom försiktig pipettering. Späd suspensionen med mer Isolationbuffer och centrifugera igen i 15 min vid 8500g.
14. Kasta bort vätskefasen, Återsuspendera pelleten i Resuspending Buffer (en isotonisk buffert av val) och centrifugera igen.
15. Den resulterande bruna pellets innehåller tvättas intakt mitokondrier. Återsuspendera pelleten i en mycket liten mängd isotonisk buffert som du väljer.

Figur 1. Scheme som visar steg för steg av isolering hos råtta hjärta mitokondrier. Övre delen, scener 1-9: vävnad störningar, trypsin behandling och homogenisering, nedre delen, steg 10-15: differential centrifugering.

Discussion

Detaljerade snabb protokoll för isolering av intakt mitokondrier med en hög grad av koppling beskrivs. Framställda preparatet kan användas för funktionell eller strukturell forskning om cellulära bioenergetik, proteomik eller analyser av mitokondrie-DNA och fett. Biofysiska studier av aktiv transport av joner och metabola intermediärer kan också göras. Det är möjligt att ytterligare bearbeta mitokondriella förberedelser för att isolera submitochondrial partiklar, yttre membran eller rena separata komponenter av oxidativ fosforylering. Den beskrivna metoden är en modifiering av standardprotokollet av isolering av Jacobus och Saks ^1. Den förväntade avkastningen av det beredda mitokondrier är cirka 10-15 mg av mitokondrie protein per hjärtat och andningsorganen kontroll förhållande på malat / glutamat sådant preparat varierar mellan 8 och 12 med staten IV andning på cirka 0,12 mikromol O ₂ xmin ^-1 xmg protein ^-1 vid 23 ° C på medellång består av 0,25 M sackaros, 10 mm KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mm kaliumfosfat (pH 8,0) med 150 mikroM ADP för initiering staten III andning (för exakt experimentella förhållanden och tillägg, se ref . ^2).

Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt att flera tekniska detaljer innan start av isolering förfarande. Det är viktigt att använda rena polykarbonat eller polypropen centrifugrör, därför rör bör tvättas noggrant med en ren borste och varmt vatten, men den tvättmedel behandling bör hållas på ett minimum. Dessutom är det bättre att samla in all nödvändig glas och instrument i det kalla rummet en dag innan isolering.

Under isoleringen vid överföring buffertar från flaskor till bägare, bör а särskild uppmärksamhet ägnas att undvika droppar isvatten till lösningar. Vid hantering av vävnader det bör betonas att hjärtat utvinningen bör genomföras så snart som möjligt eftersom även kort fördröjning mellan halshuggning av djuret och kylning vävnaden skulle resultera i delvis frikopplad mitokondrier. Snabb nedkylning och grundlig tvättning av borttagna hjärtan är viktigt att få vanliga blandningen som är fri från hemoglobin och erytrocytporfobilinogen NADase.

Trypsin används för bindväv proteiner nedbrytning för att öka känsligheten av vävnaden till klippning kraft under homogenisering. Långvarig exponering av vävnad proteas bör undvikas, eftersom det resulterar i mitokondrierna av sämre kvalitet.

Efter snabb centrifugering väggarna i centrifugrör torkas med läskpapper att avlägsna alla avlagringar av fett material som samlats på väggarna.

För de sista resuspension är det bättre att använda en låg volym av de slutliga buffert för att minimera förlust av mitokondrie-funktioner under lagring (150 till 200 ìl av buffert per hjärtat). För studier av transport av tvåvärda katjoner ingen kelatbildare måste finnas i den slutliga beredningen alltså mitokondrierna ska tvättas flera gånger med EGTA-fria medium och används inom första timmarna efter isolering.