Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias

Summary

Descrevemos а protocolo para o isolamento de puro coração de rato, altamente acoplado mitocôndria para estudos funcionais ou estruturais da bioenergética celular, medições biofísicas, proteômica ou DNA mitocondrial e análise de lipídios.

Abstract

A função da mitocôndria na geração de ATP celular no processo de fosforilação oxidativa é amplamente reconhecida. Durante as últimas décadas tem havido avanços significativos em nossa compreensão das funções de outras mitocôndrias do que a geração de energia. Estes incluem o seu papel na apoptose, agindo como organelas de sinalização, desenvolvimento de mamíferos e envelhecimento, bem como sua contribuição para a coordenação entre o metabolismo celular e proliferação celular. Nossa compreensão dos processos biológicos modulada pela mitocôndria é baseado em métodos robustos para isolamento e manipulação de mitocôndrias intactas de tecidos dos animais de laboratório. Mitocôndrias de coração de rato é uma das preparações mais comum para estudos anteriores e atuais do metabolismo celular, incluindo estudos sobre animais knock-out.

Aqui nós descrevemos um método detalhado rápida para o isolamento de mitocôndrias intactas com um alto grau de acoplamento. Tal preparação de coração de rato mitocôndria é um objeto excelente para investigação funcional e estrutural sobre bioenergética celular, transporte de biomoléculas, os estudos de proteômica e análise de DNA mitocondrial, proteínas e lipídios.

Protocol

Introdução

Mitocôndrias de coração de rato é uma das preparações mais comum para estudos anteriores e atuais do metabolismo celular. Eles podem ser obtidos de forma rápida e confiável em grande quantidade do tipo selvagem ou knock-out animais. O procedimento geral consiste de digestão dos tecidos por fracionamento de tripsina, e centrifugação diferencial.

Existem várias condições que devem ser mantidas durante o isolamento de mitocôndrias de vários tecidos, incluindo o coração (Fig. 1).

• O tecido tem de ser completamente picada, uma vez que afeta diretamente a produção de mitocôndrias obtidos. Tecido do coração é melhor para mince com pequenas tesouras curvas e pode ser seguido pelo uso de um moedor de tecido Latapie ou, se um moedor de tecido não estiver disponível, um espremedor de alho com diâmetro de saída buracos de cerca de 1,0 mm de diâmetro.
• É necessário para manter a temperatura das soluções em cada etapa. Portanto, todo o procedimento tem que ser realizado em uma sala fria e todos os instrumentos e as soluções têm que ser preparados e refrigerados com antecedência. Se as condições de temperatura não são mantidos estáveis ​​várias propriedades da preparação pode ser perdida. Estrutura mitocondrial é muito sensível ao congelamento de modo sobrearrefecimento da suspensão (por exemplo, durante a centrifugação) não é permitido, especialmente se os estudos de transporte ativo são importantes.
• Um parâmetro importante é o tempo de duração do procedimento, o isolamento deve ser realizada o mais rápido possível e obtida a preparação tem que ser utilizado imediatamente. Portanto, instrumentos cirúrgicos, soluções e aparelhos devem ser preparadas com antecedência.

Materiais e instrumentos

Instrumentos

1. Tesoura reta de operação, ponta afiada
2. Tesoura curva
3. Fórceps
4. Placa de Petri
5. + Funil pequeno pedaço de nylon filtro (pré-lavado)
6. 6 copos de 50 ml
7. Dois agitadores magnéticos e dois banhos de gelo
8. Um banho de gelo grande
9. 2 pequenas barras magnéticas
10. Espátulas para pellet raspagem
11. Tubos de centrífuga
12. Latapie imprensa tecido (pode ser substituído com espremedor de alho)
13. Teflon de vidro homogeneizadores 20ml e 1-2ml
14. Copo resíduos
15. Tubos Eppendorf para suspensão mitocondrial final e amostras para determinação de proteínas
16. Banhos de gelo

Solutions (calculado por dois ratos):

1. Tampão de lavagem: 0,3 M sacarose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Tampão de isolamento: 0,3 M sacarose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (100 ml preparada a partir do buffer de lavar). Soro albumina bovina pode ser substituído por menos caro fatty acid-free análogos. Mesmo tampão isotônica ou suas variações podem ser usados ​​como ressuspensão buffer.
3. Solução de tripsina (Sigma T8003): 2.5mg/ml em HCl 1mM (0,5 ml)
4. Inibidor de tripsina de soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de tampão de isolamento

Protocolo

O esquema geral do procedimento é mostrado na fig. 1. Corações deve ser resfriado e lavado em tampão de lavagem do tecido ventricular, excisadas, picadas e homogeneizadas durante o tratamento com tripsina fotolítica. A suspensão é centrifugada em baixa velocidade eo sobrenadante obtido é centrifugado novamente a uma velocidade maior para coletar mitocôndrias. Dependendo do buffer de experiências planejadas ressuspensão pode ser substituída por qualquer outra solução isotônica.

Os animais foram terminados de acordo com o Reino Unido "Animals (Scientific Procedures) Act". por deslocamento cervical seguida por decapitação. É necessário extrair o coração imediatamente após a decapitação do animal, de modo que não há atraso entre o desligamento de animais e extração de coração. Se o isolamento paralelo de fígado mitocôndria é esperado que os ratos devem estar em jejum durante a noite antes do experimento.

1. Prepare três copos contendo 40 ml de tampão de lavagem. Resfriá-los no banho de gelo-sal por 3 a 5 min antes de prosseguir para a próxima etapa. Certifique-se de não overfreeze-los e usá-lo imediatamente, logo após nuvens de cristais de gelo começam a aparecer.
2. Abrir o tórax do rato decapitado e extrair o coração. Faça pequenas incisões e, em seguida, transferir imediatamente o coração para a solução gelada no copo primeiro. Espremer o coração para remover o sangue e colocá-lo no copo segundo. Repita esta operação para cada coração.
3. Secar o coração no papel filtro. Remover todo o sangue, de gordura coagulada, aurículas e fáscias e piscina no tecido ventricular.
4. Picar o tecido reunidos com pequenas tesouras curvas na placa de Petri sobre gelo por cerca de 5 min até que o tamanho das partículas é cerca de 1-2 mm.
5. Coloque o tecido picada na imprensa tecido e passar-lo completamente. Estar ciente de que uma quantidade substancial de material pode permanecer na imprensa para coletar todos os tecidos do coração das paredes e do fundo da imprensa.
6. Transferência do material para o copo com 50 ml Tampão de Lavagem e mexa. Em seguida, filtrar a suspensão por um filtro de nylon. Lavar o tecido picada no filtro 3 vezes com a solução de lavagem e descartar o filtrado.
7. Transferir os tecidos lavados em 20 ml de tampão de lavagem e colocá-lo no banho de gelo sobre o agitador magnético. Adicionar 0,5 ml de solução de tripsina, sob agitação constante e iniciar o temporizador. Prepare outra agitador magnético, banho de gelo e um copo ml segundo 50.
8. No minuto 4 ^ª brevemente homogeneizar a parte de suspensão, por parte utilizando uma pequena apertada frouxamente vidro Teflon homogeneizador (10-15ml) com várias pinceladas para cima e para baixo para dispersar a suspensão. Após a homogeneização transferir a suspensão para o segundo béquer. Repita o procedimento no minuto 9 ^º, de modo que você executa a homogeneização da suspensão duas vezes no total. Após 15 min de incubação, adicione 10 ml de isolar tampão contendo inibidor de tripsina e incubar por 1 min.
9. Filtrar a suspensão de novo através de um filtro de nylon e salvar o filtrado. Recolher a fração de partículas deixada em um filtro e homogeneizar por 1 minuto em 15-20 ml de tampão de lavagem.
10. Combine o homogeneizado com o filtrado e centrifugar por 15 minutos a 600g.
11. Cuidadosamente o sobrenadante do filtro, resultando em um novo tubo de centrífuga. Evitar a contaminação pela pelota e centrifugar novamente por 15 min a 8500g.
12. Após a centrifugação de alta velocidade desprezar o sobrenadante e lavar o pellet 2-3 vezes com 1 ml do tampão descartando a camada de aro branco macio exterior. Quebrar o pellet com a espátula, mas evitar a mancha vermelha de eritrócitos na parte inferior. Se as células do sangue tem loos, retire os pedaços vermelhos da suspensão antes da homogeneização.
13. Ressuspender o sedimento com um homogeneizador pequena ou, alternativamente, por pipetagem suave. Diluir a suspensão com mais Isolationbuffer e centrifugar novamente por 15 min a 8500g.
14. Desprezar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em ressuspensão Buffer (um tampão isotônica de escolha) e centrifugar novamente.
15. O resultado marrom pellet lavado contém mitocôndrias intactas. Ressuspender o sedimento em um volume muito pequeno de tampão isotônica de sua escolha.

Figura 1. Esquema demonstrando o procedimento passo a passo de isolamento de coração de rato mitocôndrias. Parte superior, Stages 1-9: rompimento do tecido, o tratamento de tripsina e homogeneização; parte inferior, estágios 10-15: centrifugação diferencial.

Discussion

Protocolo rápida detalhadas para o isolamento de mitocôndrias intactas com um alto grau de acoplamento é descrito. Preparação obtidos podem ser utilizados para investigação funcional ou estrutural na bioenergética celular, estudos proteômicos ou análise de DNA mitocondrial e do conteúdo lipídico. Estudos biofísicos de transporte ativo de íons e intermediários metabólicos também podem ser executadas. É possível ainda mais o processo de preparação mitocondrial a fim de isolar partículas submitocondriais, membrana externa ou purificar componentes separados de fosforilação oxidativa. O método descrito é uma modificação do protocolo padrão de isolamento por Jacobus e Saks ^1. O rendimento esperado das mitocôndrias preparado é de aproximadamente 10-15 mg de proteína mitocondrial por coração e da razão de controle respiratório em malato / glutamato desta preparação varia entre 8 a 12 com a respiração IV Estado de cerca de 0,12 mmol ₂ xmin O ^-1 proteína XMG ^-1 a 23 ° C no meio composto de sacarose 0,25 M, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato de potássio (pH 8,0) com 150 mM ADP para a iniciação da respiração III Estado (para as condições exactas experimental e adições, ver ref . ^2).

Especial atenção deve ser dada a vários detalhes técnicos antes do início do procedimento de isolamento. É crucial para utilização limpa policarbonato ou tubos de centrífuga de polipropileno, portanto tubos devem ser cuidadosamente lavados com uma escova limpa e água quente, no entanto o tratamento de detergente deve ser mantido no mínimo. Além disso, é melhor recolher todos os vidros e os instrumentos necessários na sala fria de um dia antes do isolamento.

Durante o isolamento durante a transferência de buffers de frascos para copos, а atenção especial deve ser dada para evitar que gotas de água gelada para as soluções. Ao manusear tecidos deve sublinhar-se que a extração do coração deve ser realizada o mais rapidamente possível uma vez que mesmo pequeno atraso de tempo entre a decapitação do animal e de resfriamento do tecido resultaria em mitocôndrias parcialmente desacoplado. Resfriamento rápido e lavagem completa dos corações removido é essencial para obter preparação padrão, livre de hemoglobina e eritrócitos NADase.

Tripsina é usada para a degradação de proteínas conjuntivo para aumentar a susceptibilidade do tecido à força de cisalhamento durante a homogeneização. A exposição prolongada do tecido a protease deve ser evitado, pois resulta em mitocôndrias de qualidade inferior.

Após centrifugação de alta velocidade nas paredes dos tubos de centrífuga deve ser limpo com lenço de papel para remover quaisquer depósitos de material de gordura acumulada nas paredes.

Para a ressuspensão final, é melhor usar um volume baixo do buffer final, a fim de minimizar a perda de funções mitocondrial durante o armazenamento (150 a 200 l do tampão por coração). Para estudos do transporte de cátions bivalentes não quelantes devem estar presentes na preparação final, assim, as mitocôndrias devem ser lavadas várias vezes com EGTA livre de médio e utilizado dentro primeiras horas após o isolamento.