Préparation de coeur de rat fortement couplées Mitochondries

Summary

Nous décrivons le protocole а pour l'isolement de pur, de coeur de rat fortement couplées mitochondries pour des études fonctionnelles ou structurales de la bioénergétique cellulaire, mesures biophysiques, la protéomique ou l'ADN mitochondrial et l'analyse des lipides.

Abstract

La fonction des mitochondries dans la production d'ATP cellulaire dans le processus de la phosphorylation oxydative est largement reconnue. Durant les dernières décennies il ya eu des avancées significatives dans notre compréhension des fonctions des mitochondries que d'autres la production d'énergie. Il s'agit notamment de leur rôle dans l'apoptose, la signalisation agissant comme des organites, le développement des mammifères et le vieillissement ainsi que leur contribution à la coordination entre le métabolisme cellulaire et la prolifération cellulaire. Notre compréhension des processus biologiques modulés par les mitochondries est basé sur des méthodes robustes pour l'isolement et la manipulation des mitochondries intactes à partir des tissus des animaux de laboratoire. Les mitochondries du coeur de rat est l'une des préparations les plus courantes pour les études passées et actuelles du métabolisme cellulaire, y compris des études sur les animaux knock-out.

Nous décrivons ici une méthode détaillée rapide pour l'isolement des mitochondries intactes avec un haut degré de couplage. Une telle préparation du cœur de rat mitochondries est un excellent objet pour la recherche fonctionnelle et structurelle sur la bioénergétique cellulaire, le transport de biomolécules, des études protéomiques et l'analyse de l'ADN mitochondrial, les protéines et les lipides.

Protocol

Présentation

Les mitochondries du coeur de rat est l'une des préparations les plus courantes pour les études passées et actuelles du métabolisme cellulaire. Ils peuvent être obtenus rapidement et sûrement en grande quantité à partir de type sauvage ou animaux knock-out. La procédure générale se compose de la digestion des tissus par la trypsine, de fractionnement et de centrifugation différentielle.

Il ya plusieurs conditions qui doivent être conservés pendant l'isolement des mitochondries de divers tissus, y compris le cœur (fig. 1).

• Le tissu doit être soigneusement haché, car elle affecte directement le rendement des mitochondries obtenues. Tissu cardiaque est préférable de mâche avec de petits ciseaux courbes et peut être suivie par utiliser un broyeur de tissus Latapie, ou, si un broyeur de tissus ne sont pas disponibles, un presse-ail avec sortie trous d'un diamètre d'environ 1,0 mm de diamètre.
• Il est nécessaire de maintenir la température des solutions à chaque étape. Donc toute la procédure doit être effectuée dans une chambre froide et tous les instruments et les solutions doivent être préparées et refroidies à l'avance. Si les conditions de température ne sont pas restés stables plusieurs propriétés de la préparation peut être perdu. La structure mitochondriale est très sensible à la congélation de sorte overfreezing de la suspension (par exemple lors de la centrifugation) n'est pas permise, surtout si les études de transport actif sont importants.
• Un paramètre important est le temps-durée de la procédure; l'isolement doit être effectuée aussi rapidement que possible et de la préparation obtenue doit être utilisée immédiatement. Par conséquent, des instruments chirurgicaux, des solutions et des appareils doivent être préparés à l'avance.

Matériel et instruments

Instruments

1. Droit Ciseaux d'exploitation, point pointu
2. Ciseaux courbes
3. Forceps
4. Boîte de Petri
5. Petit entonnoir + morceau de filtre en nylon (prélavés)
6. 6 béchers de 50 ml
7. Deux agitateurs magnétiques et deux bains de glace
8. Un grand bain de glace
9. 2 petites barres magnétiques
10. Spatules à granulés gratter
11. Tubes à centrifuger
12. Appuyer sur le tissu Latapie (peut être remplacé par presse-ail)
13. Téflon-verre homogénéisateurs 20ml et 1-2ml
14. Bécher déchets
15. Des tubes Eppendorf de suspension mitochondriale finale et des échantillons pour le dosage des protéines
16. Bains de glace

Solutions (calculé par 2 rats):

1. Tampon de lavage: 0,3 M de saccharose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM d'EDTA (1000 ml)
2. Tampons Isolement: 0,3 M de saccharose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (100ml préparés à partir de la mémoire tampon de lavage). L'albumine sérique bovine peut être remplacé par moins chère d'acides gras libres analogues. Le même tampon isotonique ou de ses variations peut être utilisé comme remise en suspension de mémoire tampon.
3. La trypsine (Sigma T8003) solution: 2.5mg/ml de 1mM HCl (0,5 mL)
4. Inhibiteur de la trypsine du soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de tampon d'isolement

Protocole

Le régime général de la procédure est indiquée sur la Fig. 1. Coeurs doivent être refroidis et lavés dans laver tissu ventriculaire tampon, excisée, hachée et homogénéisée pendant le traitement à la trypsine photolytique. La suspension est centrifugée à basse vitesse et le surnageant obtenu est centrifugé à nouveau à vitesse plus élevée pour recueillir les mitochondries. Selon les expériences prévues le tampon resuspendant peut être remplacé par n'importe quelle autre solution isotonique.

Les animaux ont été résilié en conformité avec le Royaume-Uni "Animals (Scientific Procedures) Act." par dislocation cervicale suivie par décapitation. Il est nécessaire d'extraire le cœur immédiatement après la décapitation de l'animal, afin qu'il n'y ait aucun délai entre la cessation des animaux et de l'extraction du coeur. Si l'isolement parallèle des mitochondries de foie est attendu, les rats doivent être mis à jeun pendant une nuit avant l'expérience.

1. Préparer trois béchers contenant 40 ml de tampon de lavage. Les refroidir dans le bain de glace-sel pendant 3 à 5 min avant de passer à l'étape suivante. Assurez-vous de ne pas les overfreeze et utiliser immédiatement, juste après les nuages ​​de cristaux de glace commencent à apparaître.
2. Ouvrez la cage thoracique du rat décapité et extraire le coeur. Faire de petites incisions et ensuite transférer immédiatement au cœur de la solution glacée dans le bécher d'abord. Presser le coeur d'enlever le sang et le mettre dans le second bécher. Répétez cette opération pour chaque cœur.
3. Sécher le cœur sur le papier filtre. Retirez toute la graisse, du sang coagulé, oreillettes et des fascias et la piscine du tissu ventriculaire.
4. Emincez les tissus mis en commun avec les petits ciseaux courbes sur le plat de Pétri sur la glace pendant environ 5 min jusqu'à ce que la taille des particules est d'environ 1-2 mm.
5. Mettez le tissu hachée dans la presse du tissu et de passerc'est à travers. Soyez conscient qu'une quantité substantielle de la matière peut demeurer dans la presse afin de recueillir tous les tissus du cœur de la parois et le fond de la presse.
6. Transférer le matériel dans le bécher avec 50 ml tampon de lavage et remuer. Puis filtrer la suspension à travers un filtre en nylon. Laver les tissus hachés sur le filtre 3 fois avec le tampon de lavage et jeter le filtrat.
7. Transfert le tissu lavé dans 20 ml de tampon de lavage et de le placer dans le bain de glace sur l'agitateur magnétique. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine sous agitation constante et lancer le chronomètre. Préparer un autre agitateur magnétique, bain de glace et un second 50 bécher.
8. Sur le 4 ^ème minute brièvement homogénéiser la portion par portion de suspension à l'aide d'un petit vaguement équipée de verre téflon homogénéisateur (10-15ml) avec plusieurs coups de haut en bas pour disperser la suspension. Après homogénéisation de transfert de la suspension dans le second bécher. Répétez la procédure sur la 9 ^ème minute, de sorte que vous effectuez l'homogénéisation de la suspension de deux fois au total. Après 15 min d'incubation, ajouter 10 ml d'isoler inhibiteur de la trypsine tampon contenant et incuber pendant 1 min.
9. Filtrer la suspension à nouveau à travers un filtre en nylon et enregistrez le filtrat. Recueillir la fraction de particules à gauche sur un filtre et homogénéiser pendant 1 min dans 15-20 ml de tampon de lavage.
10. Combinez l'homogénat avec le filtrat et centrifuger pendant 15 min à 600g.
11. Soigneusement filtrer le surnageant résultant dans un tube de centrifugeuse de nouvelles. Eviter la contamination par le culot et centrifuger à nouveau pendant 15 min à 8500G.
12. Après centrifugation à grande vitesse jeter le surnageant et rincer les 2-3 granulés fois avec 1 ml de tampon de l'abandon de la couche blanche duveteuse bord extérieur. Brisez le culot avec la spatule, mais éviter la tache rouge des érythrocytes dans le fond. Si les cellules du sang obtenu Loos, retirez les morceaux rouges de la suspension avant homogénéisation.
13. Reprendre le culot avec un homogénéisateur petites ou alternativement par pipetage doux. Diluer la suspension avec plus Isolationbuffer et centrifuger à nouveau pendant 15 min à 8500G.
14. Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans du tampon remise en suspension (un tampon isotonique de choix) et centrifuger à nouveau.
15. Le brun résultant culot contient lavés mitochondries intactes. Reprendre le culot dans un très petit volume de tampon isotonique de votre choix.

Figure 1. Schéma montrant la procédure étape par étape d'isolement des mitochondries de coeur de rat. Partie supérieure, Étapes 1-9: désorganisation tissulaire, traitement à la trypsine et l'homogénéisation; partie inférieure, les stades 10-15: centrifugation différentielle.

Discussion

Détail du protocole rapide pour l'isolement des mitochondries intactes avec un haut degré de couplage est décrit. Préparation obtenue peut être utilisée pour la recherche fonctionnelle ou structurelle sur la bioénergétique cellulaire, les études protéomiques humaines ou des analyses de l'ADN mitochondrial et la teneur en lipides. Des études de biophysique du transport actif des ions et des intermédiaires métaboliques peuvent également être effectuées. Il est possible de continuer à traiter la préparation mitochondriale afin d'isoler les particules submitochondrial, la membrane externe ou purifier des composants séparés de la phosphorylation oxydative. La méthode décrite est une modification du protocole standard de l'isolation par Jacobus et Saks ^1. Le rendement attendu de la mitochondrie prêt est d'environ 10-15 mg de protéine mitochondriale par cœur et le rapport de contrôle sur les voies respiratoires malate / glutamate de cette préparation varie entre 8 à 12 ans avec l'État IV de respiration de l'ordre de 0,12 mol O ₂ protéines xmin ^-1 XMG ^-1 à 23 ° C dans le milieu comprenant 0,25 M de saccharose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM de phosphate de potassium (pH 8,0) avec ADP uM 150 pour l'initiation d'Etat III respiration (pour les conditions exactes d'expérimentation et d'ajouts, voir réf . ^2).

Une attention particulière devrait être accordée à plusieurs détails techniques avant le départ de la procédure d'isolement. Il est crucial d'utilisation propre polycarbonate ou des tubes à centrifuger en polypropylène, donc les tubes doivent être soigneusement lavés avec un pinceau propre et l'eau chaude, mais le traitement au détergent doit être conservé au minimum. Aussi, il est préférable de prélever toute la verrerie et les instruments nécessaires dans la chambre froide un jour avant l'isolement.

Pendant l'isolement lors du transfert des flacons de tampons aux béchers, а une attention particulière devrait être accordée à éviter les chutes d'eau glacée dans les solutions. Lors de la manipulation des tissus, il faut souligner que l'extraction du cœur doit être effectuée dès que possible, car même à court délai entre la décapitation de l'animal et le refroidissement des tissus se traduirait dans les mitochondries partiellement découplées. Le refroidissement rapide et un lavage soigneux des cœurs enlevés est essentiel pour obtenir une préparation standard, libre de l'hémoglobine et des érythrocytes NADase.

La trypsine est utilisée pour la dégradation des protéines conjonctif pour augmenter la sensibilité des tissus à force de cisaillement lors de l'homogénéisation. Une exposition prolongée des tissus à la protéase doit être évitée car elle entraîne dans les mitochondries de qualité inférieure.

Après centrifugations grande vitesse, les parois des tubes à centrifuger doivent être essuyés avec du papier absorbant pour enlever les dépôts de matériel graisse accumulée sur les murs.

Pour la remise en suspension finale, il est préférable d'utiliser un faible volume de la mémoire tampon final, afin de minimiser la perte de fonctions mitochondriales au cours du stockage (150 à 200 pi de la mémoire tampon par cœur). Pour les études du transport des cations divalents chélateurs ne doit être présente dans la préparation finale ainsi mitochondries doivent être lavées plusieurs fois avec EGTA milieu exempt et utilisée dans les premières heures après l'isolement.