Summary
וידאו זה מדגים את הטכניקות כללי המשמש האחורי אנופלס gambiae במעבדה. שיטות עבור הטיפול יתושים מעבדה הם הפגינו לאורך כל שלבי מחזור החיים של האורגניזם מ זחלים וגלמים אל על דם האכלה מבוגרים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר גידול יתושים insectary. החדרים insectary מתוחזקים על 28 ° C ו ~ לחות 80%, עם 12 שעות. יום / לילה מחזור. עבור הליך זה, תצטרך כלובים יתושים, 10% סוכרוז פתרון סטרילי, מגבות נייר, כוס נייר, whatman לסנן, ניזונים זכוכית, דם אדם ואמבטיה בסרום, מים, parafilm, מים מזוקקים, מגשי פלסטיק נקיים, מזון יתוש (כמתואר להלן), רשת יתושים על מנת לכסות את המגשים, ואקום, וחדר אוסף לאסוף מבוגרים.
Protocol
יתוש מזון:
- מזון: מזון דגים מוארק (Aquaricare). קמצוץ קטן צריך להיות הוסיף.
- מזון ב ': מקורקע מזון CAT (פורינה). קמצוץ קטן צריך להיות הוסיף.
- מזון C: חתול מזון (פורינה). שתי טבליות צריך להיות הוסיף.
דם:
בעלי חיים או דם אדם יכול לשמש יתושים האחורי. דם טרי נאסף עם מזרק ולשים צינור סטרילי פלקון 15 מ"ל המכיל 1ml של עלות לכל יום (נוגד קרישה) עבור כל 10 מ"ל של דם, ואז מערבבים אותו בעדינות centrifuged בטמפרטורת החדר ב 2000 סל"ד במשך 5 דקות. Supernatant נמחקת, מקפיד להסיר את המעיל באפי המהווה כדוריות דם אחרים (למשל, WBC). גלולה RBC מושעה אז pipetting בנפח שווה של המדיום RPMI, ורחץ נוספת זה שלוש פעמים בינוני. לאחר לשטוף הסופי, RBCs pelleted הם resuspended בנפח שווה של המדיום RPMI ומאוחסן על 4 ° C (אפשר לשמור על 80-10 ימים). ממש לפני האכילה, RBC (ב RPMI) הוא centrifuged (2000 סל"ד במשך 5 דקות) כדי גלולה את התאים, ואת RBC ארז הוא resuspended בסרום (O + אדם נסיוב) להשיג המטוקריט 40%. הדם חייב להישמר על 37 ° C תמיד להזנת.
יום 1:
- 3-5 הישן יום הנקבה הבוגרת יתושים ניזונים על דם להטיל ביצים.
- להזנת דם, קרום מלאכותי (parafilm) שיטת האכלה משמש כדלקמן:
- כדוריות דם אדומות (ראה לעיל להכנת דם) מעורבבים עם סרום חום מומת להשיג המטוקריט ~ 40% (ארז RBC 40% ו% בסרום 60). זה מתווסף מזין את הזכוכית.
- מזין מחוברת חם מים ז'קט (37 ° C), והניח על הכלוב כדי לאפשר גישה יתושים על פני השטח קרום.
- יתושים מותר להאכיל עבור ~ 30 דקות.
יום 3:
- הנקבות יטילו את הביצים יומיים אחרי שהם ניזונים מדם. נייר מסנן קטן עטוף צורה חרוטית היא לשים כוס קטן המכיל מים מזוקקים, ולוודא כי נייר לסנן מקבל לחות. כוס נשמרת בתוך כלוב למשך הלילה היתושים להטיל ביצים.
יום 4:
- העיתון המכיל מסנן את הביצים יתוש ממוקם מגש פלסטיק עם מים ~ 300 מ"ל מזוקקים. קמצוץ של מזון מתווסף מגש ביצים מותר בוקעים זחלים במהלך הימים הקרובים.
ימים 5-8:
- גידול הזחלים ניזונים כל יום עם שתי טבליות של מזון C, פיקוח על צפיפות האוכלוסייה. ביום השמיני (זחלים בן 5 ביום), אוכלוסיית הזחלים הוא מדולל ממגש 1 ל ~ 10 מגשים, עם קמצוץ של מזון ושתי טבליות של C אוכל כל מגש. (~ 30 דקות)
ימים 9 - 12:
- הזחלים ניזונים בכל יום עם אוכל ג ביום ה -12 (9 הזחלים יום הישן), המים משתנה עם מים טריים, מזון נוסף (קמצוץ מזון B ושתי טבליות של מזון C). גלמים מתחיל לפתח בשלב זה. מגשים מכוסים רשתות כדי למנוע בריחה של מבוגרים. (~ 80-10 דקות)
יום 13 - 15:
גלמים מותר לצאת למבוגרים של 2 הבא - 3 ימים. מזון הוא נתון בכל יום זחלים / גלמים בקפידה על ידי הסרת נטו כדי למנוע בריחה של מבוגרים.
יום 16:
- המבוגרים נאספים לכלוב דרך aspirator מחובר ואקום. כלוב מורכב של בקבוק 100 מ"ל קטן עם פתיל כותנה כי היא ספוגה סוכרוז 10% (autoclaved) ו מגבת נייר רירית בתחתית לספוג כל נשפך סוכר פוטנציאליים אשר עשויים להתרחש במהלך טיפול בכלוב. (~ 30-40 דקות)
יום 17-21:
- המבוגרים (גם זכרים ונקבות) נשמרים אז בחדר insectary 4-5 ימים, שניזון סוכרוז 10% לפני שהם שוב דם-fed כדי להתחיל את המחזור הבא. יתושים אותו ניתן להשתמש בו כדי להטיל ביצים יותר מפעם אחת.
- יתושים כי אין צורך בניסויים או גידול יכול להיות נהרג על ידי הצבת כלוב במקפיא. מגשי משומשים כלובים יש לנקות מיובשים לפני שניתן יהיה להשתמש בהם שוב.
הערה: לא יכול להיות כמה וריאציות בשיטת גידול יתושים מעבדות שונות ייתכן בטכניקות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
- Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
- Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
- Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
- Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
- Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
- Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
- Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30 (4), 49 (2005).
- Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).
