Summary
נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.
Abstract
כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) התפתחה ככלי מדויק יקר פרופיל רמות ביטוי הגנים. אחד היתרונות הרבים גבול גילוי נמוכה בהשוואה לשיטות אחרות של פרופילי ביטוי גנים, תוך שימוש בכמויות קטנות של קלט עבור כל assay. התקנה אוטומטית qPCR השתפר בתחום הזה על ידי המאפשר שחזור יותר. ההתקנה נוחה ומהירה שלה מאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, המאפשרת אפיון של גנים רבים ושונים בו זמנית בכל ניסוי. שיטה זו, יחד עם צלחת בקרות פנימיות גם מקטין את משתני הניסוי המשותף טכניקות אחרות. אנחנו לאחרונה פיתחה assay qPCR עבור פרופילים של טרום רנ"א (טרום miRNAs) באמצעות סדרה של 186 זוגות פריימר. מיקרו RNA צמחו כמעמד של רומן קטן, ללא קידוד RNAs עם היכולת לווסת את מטרות mRNA רבים ברמה שלאחר תעתיק. RNAs אלה קטן מתועתקים הראשונה מירנה תעתיק הראשי (פרי, מירנה), אשר ביקע מכן לתוך מירנה המבשר (טרום מירנה) על ידי RNA פולימראז II. טרום miRNAs מיוצאים הציטופלסמה שבה דייסר cleaves את הלולאה מכבנה להניב miRNAs בוגרת. עליות ברמות מירנה ניתן לצפות ב מבשר והן רמות מירנה בוגרת פרופיל של שתי צורות אלה יכול להיות שימושי. ישנם מבחני זמינים מסחרית מספר miRNAs בוגרת, אך העלות הגבוהה שלהם עשוי להרתיע חוקרים טכניקה זו פרופיל. כאן, אנו דנים חסכונית, אמינות, SYBR מבוססי שיטה qPCR של אפיון מראש miRNAs. שינויים מירנה מראש רמות לעתים קרובות לשקף שינויים מירנה בוגרת יכולה להיות אינדיקציה שימושית הביטוי מירנה בוגרת. עם זאת, פרופיל סימולטני של שתי טרום miRNAs ו miRNAs בוגרת יכול להיות אופטימלי כפי שהם יכולים לתרום מידע nonredundant ולספק תובנות עיבוד microRNA. יתרה מכך, טכניקה המתואר כאן ניתן להרחיב להקיף את פרופיל של קבוצות אחרות ספריית המסלולים או פתוגנים ספציפיים.
Protocol
טרום מירנה מערכים qPCR פרופיל ניתן להגדיר בתור אוטומטי לחלוטין עם חופש לטקאן Evo רובוט (א) או על ידי ביד עם פיפטה מטריקס אלקטרוניקה רב (B).
1) מכינים את תערובת הורים, צלחות פריימר דגימות.
- צלחות פריימר המכיל 186 זוגות פריימר בפורמט 96-היטב (כולל של 2 צלחות) בשעה 12:05 צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C. הפשירי צלחות החוצה בטמפרטורת החדר, מערבולת בקצרה צנטריפוגות לפני השימוש.
- כדי להכין את תערובת הורים, להפשיר SYBR גרין 2x מערבבים PCR בטמפרטורת החדר. התגובה של כל משתמש לערבב מאסטר 8ul עם פריימר 2ul. הרכב לערבב את אב לכל תגובה היא לערבב SYBR 4ul, 3ul מים PCR כיתה ו 10-20 ng DNA מדגם או cDNA.
- עבור ההתקנה של כל צלחת פריימר 96-טוב, ארבעה צינורות לערבב אמן יהיה צורך. דוגמאות ניתן להפעיל 4 דגימות לכל צלחת (singlicate), 2 דוגמאות לכל צלחת (כפול) או מדגם יחיד ארבע פעמים.
- הכינו תערובת אמן על ידי שילוב, SYBR מים מדגם בכל אחד 4-2ml צינורות Eppendorf. הצינור אמור להכיל כל תערובת אמן מספיק כ 100 תגובות, המאפשר עודף עבור pipetting פסולת. וורטקס לערבב.
א ההתקנה של assay טרום מירנה באמצעות לטקאן חופש Evo רובוט.
- לאחר אתחול של הרובוט וטעינה של התוכנית Evoware, שטוף שלוש פעמים עם כל 30mls כדי לנקות מערכת של בועות האוויר יפריע pipetting דיוק.
- הגדרת את הפלטפורמה הרובוט לכלול את הדברים הבאים:
- תווית-384 גם צלחת
- 96 גם פריימר צלחת (1)
- מאסטר מתערבב
- שוקת אקונומיקה המכיל 2%
- נוזל במיכל מלא מערכת
- בזבוז רוקן מיכל
- בגין להפעיל רובוט אוטומטי על ידי בחירת "הפעל" פעמיים.
- בסוף התוכנית, להסיר 384-לאטום היטב צלחת עם נייר 480 איטום LightCycler ו צנטריפוגות בקצרה. המקום אטום צלחת 384 גם בעמדה 1 של המלון.
- עבור לשלב 2.2 וחזור על צלחת פריימר 2 מתערבב עם הורים חדשים צלחת 384, באר חדשה.
- מניחים צלחת חתומה בעמדה 2 של המלון.
- פתח תוכנית חדשה Evoware עבור טעינת Lightcycler מהמלון ובחר "הפעלה" פעמיים.
- חופש Evo יטען אוטומטית בכל צלחת לתוך LightCycler ולהפעיל את התוכנית הבאה SYBR ירוק I / HRM רכיבה על אופניים:
Pre (1 מחזור):
50 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
95 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
אמפר (45 מחזורים):
95 מעלות במשך 15 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
62 מעלות במשך 30 שניות כבש בקצב של 2.5 ° / sec
(רכישת נתונים יחיד במהלך שלב זה)
עקומת התכה:
95 מעלות למשך 5 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
60 מעלות למשך 1 דקה בקצב הרמפה של 2.5 ° / sec
95 ° רציפה בשיעור הרמפה של 0.11 ° / sec
עם 5 רכישות לכל ° C
מגניב:
50 מעלות במשך 30 שניות בקצב הרמפה של 25 ° / sec
- חופש Evo יטען אוטומטית בכל צלחת לתוך LightCycler ולהפעיל את התוכנית הבאה SYBR ירוק I / HRM רכיבה על אופניים:
ב ההתקנה של assay טרום מירנה בעזרת פיפטה רב אלקטרוניים מטריקס:
- מקום תוכנו של צינור לערבב מאסטר 1 למאגר.
- הגדר את פיפטה אלקטרונית לשאוב 16ul תמהיל הורים עם 2-8ul לוותר צעדים ואחריו צעד לטהר.
- עבור הורים לערבב 1, לוותר 8ul לבאר כל האחרים צלחת 384, באר (מוגדר על המרווח-384 גם טיפ), החל A1 היטב. (כלומר בארות A1, C1, E1, וכו ') במשך 8ul second לוותר, לעבור טור 3 (כלומר בארות A3, C3, E3, וכו') ולאחר מכן לטהר את מיכל פסולת טיפים להיפטר.
- בצע את הדפוס הזה במשך 5 מחזורים שנותרו עד שתגיע A23 היטב.
- חזור עבור הורים לערבב 2, (החל גם A2, C2, E2, וכו '); לערבב מאסטר 3 (החל B1, D1 היטב, F1, וכו'); לערבב מאסטר 4 (החל B2, D2, F2, etc .).
- עבור aliquotting צלחת פריימר, להגדיר פיפטה אלקטרונית לשאוב 2ul ולחלק 2ul עם הבאים צעד לטהר. לוותר 2ul של primers מהעמודה של צלחת 1-96 גם פריימר (א.ה.) לתוך צלחת 384 הבאר, בארות A1, C1, E1, וכו 'הטיהור על פני מיכל פסולת טיפים להיפטר. חזור על בארות A2, C2, E2, B1, D1, F1, ו-B2, D2, F2 וכו '
- חזור על שורות 2-12 של primers 96, טוב, נעים על כל 2 עמודים עבור כל עמודה פריימר, עד צלחת מלאה 384-היטב כבר aliquotted.
- חותם צלחות בנייר איטום LightCycler ו צנטריפוגות בקצרה.
- המקום צלחות לתוך LightCycler 480 מחזור הצלחות על פי ההגדרות הבאות באמצעות גרין SYBR I / פורמט HRM זיהוי:
Pre (1 מחזור):
50 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
95 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
אמפר (45 מחזורים):
95 מעלות במשך 15 שניות בקצב הרמפהשל 4.8 ° / sec
62 מעלות במשך 30 שניות כבש בקצב של 2.5 ° / sec
(רכישת נתונים יחיד במהלך שלב זה)
עקומת התכה:
95 מעלות למשך 5 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec
60 מעלות למשך 1 דקה בקצב הרמפה של 2.5 ° / sec
95 ° רציפה בשיעור הרמפה של 0.11 ° / sec
עם 5 רכישות לכל ° C
מגניב:
50 מעלות במשך 30 שניות בקצב הרמפה של 25 ° / sec - חזור באמצעות צלחת פריימר 2, aliquotting לתוך צלחת 384, גם טריים באמצעות תערובות מאסטר מוכן טרי.
סודות ההצלחה:
מאפיין חשוב בעת תכנון מערכי ה-PCR היא כי כל 186 זוגות פריימר יש חישול בטמפרטורה זהה, כך צלחת ניתן להפעיל את אותו הדבר האופטימלי תוכנית הגדרות ה-PCR לרוץ.
כל מערך חדש צריך להיבדק באמצעות שלוש שולטת לפני דגימות פועל. בקרות אלה הם:
1 לרוץ כל primers לרוץ עם מים או 0.1 x TE כדי לשלול זיהום פריימר.
1 להפעיל לסירוגין מים / TE ושליטה חיובית, על מנת להבטיח שום שריד.
3 פועל באמצעות השלט חיובית זאת, כדי להבטיח שחזור בין ריצות.
תערובות הורים צריכים להיות מוכנים טרי, צלחות יש להפעיל בתוך 24 שעות עבור תוצאות אופטימליות
צלחת נייר פריימר יש להסיר לאט להפחית את הסיכון של זיהום בין בארות.
כאשר באמצעות רובוט עם טיפים קבוע, לשטוף באקונומיקה 2% יש צורך לשטוף את הטיפים בין כל שלב pipetting, ובעקבותיו שטף מים. זה מונע ומונע שריד, שעלולות לזהם נתונים להוביל לתוצאות חד משמעיות.
לאחר הצלחת מנוהל באמצעות Lightcycler, זה לא אמור להיפתח שוב בחדר ההתקנה PCR. זה עוזר למנוע זיהום PCR.
נציג תוצאות:
תוצאות qPCR מיוצגים בדרך כלל על ידי ערכים CT כפי שנקבע מהתוכנה ניתוח Lightcycler. ריצה מוצלחת בדרך כלל מורכבת של מגוון רחב של CTS עבור דגימות, בדרך כלל בין 20-35 עבור דגימות חיוביות. דגימות מים בטווח טוב הם תמיד CT של> 40 וכל דגימות או בארות ספציפי עם CT מעל 37 נחשבים שליליים או לא מזוהה. ככלל, דגימות מניב CT של <10 גם כן אינן אמינות והן מחוץ ניתוח נוסף. ישנן מספר דרכים לנתח נתונים qPCR והכללה של בקרה פנימית assay שלנו מסייע לשלוט על וריאציה של קלט המדגם. מערך טרום miR כולל פריימר לשלוט U6, המשמש לעתים קרובות גן התייחסות לנרמל את ערכי ה-CT מ מדגמים שונים. ערך זה מנורמל שמכונה ה-CT דלתא ערך (DCT). התוצאות בגרף לעתים קרובות כמו CT הגלם, ערך או DCT ניתן לנתח נוסף לערכים סטנדרטיים.
באיור 1, ניתוח של המערך מראש microRNA מלא של ארבעה מדגמים שונים של ניסוי timecourse מוצג בפורמט המפה חום. הביטוי היחסי של microRNA מראש כל מוצג שלוש הגדולות, באשכולות נפרדים יצא. רוב מראש מירס עברו ניתוח קטן, שינוי משמעותי כצפוי (איור 1A). עם זאת, חלק קטן מראש רנ"א היו ירדו משמעותית (איור 1B) או גדל באופן דרמטי (תרשים 1C) לאורך הניסוי timecourse. רמות הביטוי של microRNA מראש היו כל מנורמל של timepoint 0h (מדגם 1) כמו ברמה בסיסית. במקרים מסוימים, ייתכן לציין כי חלק מראש רנ"א התקבצו גם מקבץ יחד בניתוח Heatmap (לשעבר: לתת-7 א, 1B איור). בהתאם הניסוי, אשכולות עלול להתגלות כי תלויים זיהום ויראלי, סוג התא הביטוי הספציפי של טרום טרום רנ"א או מירס כי מוסדרים על ידי מולקולה משותפת או מסלול איתות.
Assay microRNA מראש כי פיתחנו גם כוללת מספר ידוע מראש רנ"א נגיפי, גנים המקודדים על ידי סרקומה של קפוסי Associated ההרפס (KSHV) ו אפשטיין בר וירוס (EBV) בנוסף טרום מירס האדם. אלה יכולים לשמש שולטת חיובית או שלילית, בהתאם לקו תא ומצב ויראלי של דגימות בשימוש. באיור 2, CTS הממוצע ממדגם KSHV שלילי ריצה ארבע פעמים מוצגים. חשוב לציין, KSHV לנה לא זוהה במדגם זה על ידי מערך qPCR רגיש מאוד. עם זאת, U6 - הבקרה הפנימית שלנו ולתת-7 א - הביעו מאוד אנושי מראש microRNA, באו לידי ביטוי בכל הרמות לזיהוי. לבסוף, כצפוי, הביקורת השלילית של מים PCR כיתה לא הניב מוצר qPCR.
אינדיקטור נוסף של מפעיל qPCR מוצלח הוא נמס טוב עקומת ניתוח, אשר יכול לתת תובנה זיהום פוטנציאליים דגימות. כדי ליצור טמפרטורת ההתכה, צלחת מחוממת לאט אחרי PCR תושלם. כמו גדילי הדנ"א נפרדים, SYBR ירוק הוא שוחרר, אותות הקרינה פוחתת. הטמפרטורה שבה זה drאופ מתרחש בגרף, והוא ידוע בתור טמפרטורת ההיתוך של המדגם. בהתאם רצף ה-DNA, דגימות להמיס בטמפרטורות שונות זו מזו משליטת מים שלילי, אשר לא צריכה להיות טמפרטורת ההתכה מאז ה-DNA לא קיים. המוצרים PCR מתוך כל זוג צריך פריימר להמיס בטמפרטורות דומות. לדוגמה, איור 3 מראה עקומת התכה ניתוח שני פריימרים שונים באמצעות מדגם זהה כפולים. ברור כי את טמפרטורת ההתכה שונה עבור שני זוגות פריימר אבל המדגם הוא נמס בטמפרטורת בדיוק את אותו הדבר עבור לשכפל כל אחד. סימנים של מדגם רע או מזוהמים יכולים לכלול מספר פסגות ההיתוך, דבר המצביע על נוכחות של שני מקורות שונים של קלט.
באיור 1. טרום microRNA חתימות לצאת דרך אפיון באמצעות qPCR מבוסס הרומן המערך. DeltaCTU6 הממוצעת חושבה וערכים סטנדרטיים הועמסו תוכנה ArrayMinerTM, מניב 3 אשכולות שונים מוצג כ heatmaps. (א) Pre-רנ"א עם שינויים קטנים ביטוי מוצגים. טרום רנ"א אשר היו רמות ירד משמעותית (ב) או מוגבר (ג) מוצגים גם. כחול תואם רמות נמוכות יותר של ביטוי בעוד אדום מייצג עלייה ברמות הביטוי.
איור 2. הכללה של בקרות פנימיות במערך מראש microRNA qPCR מבוססות. הערכים גלם CT עבור 3 גנים שונים שליטה תבנית לא מוצגים. U6 משמש בקרה פנימית חיובית בעוד PCR H2O משמש שליטה שלילי שלנו. בואו-7a-1-1 הוא microRNA הביעו בדרך כלל הרבה סוגי תאים שונים תוך KSHV לנה יכול לשמש כביקורת חיובית או שלילית, על סמך מעמד ויראלי של קו תא או רקמה בשימוש.
איור 3. התכה ניתוח שיא של microRNA מראש primers וחוסר זיהום המדגם. עקומות התכה התקבלו באמצעות ניתוח קורא אני בתוכנה LightCycler. שני פריימרים שונים (פריימר A ו-B) עבור מדגם זהה לרוץ לשכפל מוצגים. טמפרטורת ההתכה של כל צבע יסוד שונה. עם זאת, במדגם יש רק אחד השיא, הוכחת העדר זיהום המדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
QPCR הוא assay רגישה מאוד, כי ניתן להשתמש כדי להשוות רמות ביטוי הגנים בין דגימות במחקר, כמו גם כדי לקבוע חיוביות במקרה של וירוסים. היתרון של שימוש במערכים qPCR הוא היכולת להריץ primers רבים (במקרה שלנו, 186 זוגות פריימר) עבור מדגם זה בתקופה קצרה של זמן. באמצעות רובוט pipetting כגון חופש לטקאן Evo, את משך הזמן הנדרש כדי להגדיר ניסוי למעלה, ניתן להפחית עוד יותר, ועל דיוק ועקביות של הרובוט יכול לצמצם ולמנוע טעויות pipetting. כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש חופש לטקאן Evo להקים מערך microRNA, כמו גם שיטה חלופית באמצעות פיפטה מטריקס אלקטרוניקה רב, אשר יכול להיות מיושם עבור מעבדות שאין להם גישה רובוט pipetting. מערכים qPCR גם מועיל, כי כל הגנים יכול להיות מנורמל להגדיר יחיד של גנים התייחסות לרוץ על צלחת עם זאת, הפחתת העלות ומספר התגובות.
כאמור, יש כמה תכונות מפתח הדרושים בעת תכנון מערך כזה. מכיוון שכל הדגימות על הצלחת ה-PCR יהיה לרוץ בתנאים זהים, זה הוא קריטי primers עיצוב לתפקד בטמפרטורה והגדרות אותו, או כמה זוגות פריימר ייכשל. בעת תכנון פריימרים, רצפים תמיד צריך להיבדק על ידי חיפוש תפציץ על מנת להבטיח כי יש הומולוגיה לגן העניין שלך ואין גנים אחרים.
בעת הפעלת מערך, זה קריטי, כי הסביבה היא סטרילית ללא PCR מזהמים שעלולים לגרום חיוביות שגויות. אם אפשר, PCR יש להגדיר במנדף עבודה סטרילית או חדר נקי נפרד, שבו מוצרים PCR לא משמשים. ספסלים יש לשטוף עם Eliminase, מים, אתנול, והוא נתון אור UV למשך שעה לפחות אחרי ריצה תושלם.
היתרון של שיטה זו הוא כי אסטרטגיה זו דומה חלה על כל סט של גנים להיות צדודית פשוט על ידי החלפת מערך מירנה עם מערך המכיל קבוצה שונה זוג פריימר. המעבדה שלנו כרגע מכיל מערכים עבור-miRNAs מראש, KSHV, EBV, p53, ו NFkB - כל אשר ניתן להפעיל שיטת זהים לאלה המוצגים. הגמישות של assay זה מאפשר לבצע במעבדה שלנו תפוקה גבוהה פרופיל גנטי במהירות ובאמינות לכל זוגות פריימר כי אנו רוצים המסך.
כאן, אנו תיאר את מערך באמצעות cDNA מ שורות תאים אנושיות מירנה רמות פרופיל ביטוי על הפעלה על פני תקופה של זמן. בנוסף לאפיון שורות תאים, המערך יכול לשמש גם כדי לנתח את דוגמאות קליניות. בעקבות בידוד RNA, סינתזה cDNA יכול להתבצע, ואת cDNA ניתן להפעיל באמצעות מערך לאפיין ביטוי גנים. זה יכול להיות שימושי בקביעת חיוביות ויראלי, או ביטוי הגן פרופילים כדי להמשיך ולאפיין אילו גנים שהוגברו בדגימות של חולים נגועים. לסיכום, qPCR אוטומטיות מבוססות מערכים הם מבחני לשחזור ואמין המאפשרים רגישות גבוהה לגילוי של מגוון רחב של גנים ברקמות שורות תאים מבעוד מועד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DE018304, R01DE018281. KT נתמך על ידי GM07092 T32-34 ו - ידי מענק של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל של הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) באמצעות מד גראד לתוך היוזמה. מחשב נתמך על ידי T32 CA009156.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well version |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
