Summary
Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von primären Zellen losgelöst von
Abstract
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung und Kultivierung primärer Zellen losgelöst von Drosophila Gastrula Embryonen. In kurzen, inszeniert eine große Menge von Embryonen von jungen und gesunden Fliegen gesammelt, sterilisiert und dann physisch trennen in einer einzigen Zellsuspension mit einem Glas-Homogenisator. Nachdem er auf Kulturplatten oder Kammer-Objektträgern in angemessener Dichte an Kultur-Medium, können diese Zellen weiter in mehrere morphologisch-verschiedene Zelltypen, die durch ihre spezifischen Zell-Marker identifiziert werden können differenzieren. Darüber hinaus präsentieren wir die Bedingungen für die Behandlung dieser Zellen mit doppelsträngiger (ds) RNA Gen-Knockdown zu entlocken. Effiziente RNAi in Drosophila primären Zellen erfolgt durch einfaches Baden die Zellen in dsRNA-haltigen Kulturmedium erreicht. Die Fähigkeit zur Durchführung von effektiven RNAi Störung, zusammen mit anderen molekularbiologischen, biochemischen, Cell Imaging-Analysen erlauben eine Vielzahl von Fragen, die in Drosophila primären Zellen, insbesondere in Bezug auf differenzierte Muskel-und Nervenzellen beantwortet werden.
Protocol
1. Vorbereitung fliegen Käfige
- Wachsen Drosophila (Wildtyp-Stämme wie Oregon-R oder Genotyp) in bequemen Behälter, wie 32-oz Insekten Tassen.
- Transfer neu eclosed fliegt zu großen Embryo-Sammlung Käfigen oder fliegen Bevölkerung Käfigen.
- Bewegen Sie den Käfigen in einen Raum mit einer Temperatur von ~ 25 ° C und Luftfeuchtigkeit bis 65% in einer leichten 12-h und einem dunklen 12-h-Zyklus, um die Sammlung von Synchron-Embryonen zu erleichtern.
- Pflegen Sie die Fliegen in den Käfigen, indem man sie getötet Hefepaste auf Melasse-Platten ausgestrichen. Ändern Sie die Melasse-Platten (mit abgetöteten Hefe paste) einmal täglich für 2-3 d.
2. Sammlung von Synchron-Embryonen
- Am Tag der Primär-Zelle Vorbereitung, füttern die Fliegen wth frische Platten mit abgetöteten Hefe beschichtet für eine 1-2 h vor-lay Zeitraum einfügen.
- Kurz vor dem 12-h Dunkel-Zyklus, ersetzen Sie die pre legen Platten mit frischen Melasse-Platten mit einer minimalen Menge von Hefe Paste ausgestrichen. Entsorgen Sie die pre lag Sammlung, die asynchrone älteren Embryonen enthält.
- Sammeln Embryonen für einen Zeitraum von 1-2 h
- Entfernen Sie die Platten mit den relativ synchron Bevölkerung von Embryonen und speichern bei 25 ° C für 5-6 h. Embryonen werden in den modernen Gastrulastadium zu diesem Zeitpunkt.
3. Sammlung und Reinigung von Embryonen
- Lösen Sie die Embryonen von den Platten mit einem nassen Pinsel, und anschließend gründlich mit lauwarmem Leitungswasser durch eine gestapelte Satz Siebe, so dass die Embryonen in die feinsten Sieb sammeln sich am Boden. Spülen Sie für ein paar Minuten, um so viel Hefe und fliegen Trümmer wie möglich zu entfernen.
- Tipp der Siebe, so dass die Embryonen auf einer Seite sammeln und vorsichtig waschen Sie sie aus dem Sieb in eine dechorionation Korb.
- Umzug in die Gewebekultur Haube Bereich, ohne dass die Embryonen austrocknen.
4. Homogenisierung von Embryonen und Beschichtung von Zellen
- Sterilisieren und dechorionate die Embryonen durch Eintauchen in 50% (vol / vol) Bleichmittel für 5-10 min. Spülen Sie den Embryonen von der Wand des Korbes mit 70% (vol / vol) Ethanol. Alternativ, waschen Sie die Bleiche aus Embryonen mit destilliertem Wasser, bevor Ethanol-Behandlung. Von diesem Zeitpunkt an Embryonen unter sterilen Bedingungen und in der Gewebekultur Haube behandelt werden.
- Spülen Sie den Embryonen gründlich, um das Bleichmittel und / oder Ethanol mit autoklaviertem destilliertem Wasser zu entfernen.
- Während der dechorionation Schritt füllen Dounce Homogenisator mit dem entsprechenden Volumen von Raumtemperatur M3 mittelfristig auf den Betrag von Embryonen basieren. Das Verhältnis zwischen dem Volumen des Embryos und der Medien sollten nicht mehr als 0,5-ml Embryonen werden: 40-ml-Medien (oder ~ 100-200 Embryonen / ml).
- Legen Sie die gespülten Embryonen in einem sterilisierten Becher mit der Menge des M3 Medien genug, um tauchen Embryonen. Lassen Sie die Embryonen für 2-5 min einweichen.
- Demontieren Sie die dechorionation Korb und blot die Nitex Mesh trocken sterilisiert Papierhandtücher.
- Transfer der Embryonen in den Homogenisator mit einer sterilisierten Pinsel.
- Homogenisieren vorsichtig mit kurzen Strichen mit einem losen Pistill ohne Erreichen der Boden des Röhrchens, bis alle Embryonen ausgesetzt sind. Dann vorsichtig aber fest, mit acht volle Takte zu homogenisieren. Nicht verdrehen Stößel, wie es oben und unten bewegt.
- Übertragen Sie die Homogenat in eine sterile 50-ml konische Zentrifugenröhrchen entweder durch Gießen oder Pipettieren, und die Kappe der Röhre.
- Zentrifuge für 10 min bei 40 g, Raumtemperatur Pellet die Gewebestücke, große Zellklumpen und vitelline Membranen. Übertragen Sie den Überstand mit den Zellen und Eigelb in ein sauberes Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt für 5 min.
- Vorsichtig den Überstand durch Gießen oder Pipettieren in ein sauberes Röhrchen und drehen für 10 min bei 360g, Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen. Zellpellet in 10 ml Kulturmedium (serum-freiem Medium für RNAi-Experimente).
- Graf lebensfähigen Zellen mit einer Zählkammer die Zelldichte zu schätzen. In der Zwischenzeit, wiederholen Sie Schritt 4,10 bis Pellet den Zellen.
- Resuspendieren der Zellen auf eine gewünschte Konzentration. Um zu beginnen, versuchen Sie einen Bereich von 1 ~ 5 x10 6 Zellen / ml und die Platte bei 1,7 bis 2,5 x10 5 Zellen / cm 2.
5. Primär-Zelle RNAi für Zellen, die auf eine 384-Well-Platte gewachsen
- Dispense 5 ul dsRNAs in jedes Well in einer Endkonzentration von ~ 250 ng pro Vertiefung einer 384-Well-Platte.
- Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, verzichten 10 ml (1 ~ 4x106 Zellen / ml) von primären Zellen pro Vertiefung in einem serumfreien M3-Medium in einem 384-Well-Platte mit einem anderen dsRNA in jede Vertiefung. Alternativ können die Zellen auf 8-Well-Glas Kammer-Objektträgern für die konfokale Bildgebung kultiviert werden.
- Centrifuge die Platten für 1 min bei 300g, Raumtemperatur. Kultur der Zellen in serum-freiem Medium bei 25 ° C für 22 h oder bei 18 ° C für 1-2 d.
- 30 ml Serum-haltigem Kulturmedium in jede Vertiefung. Centrifuge die Platten für 1 min bei 300g, Raumtemperatur.
- Legen Sie die Platten in einer feuchten Kammer und Kultur die primären Zellen für weitere 5 ~ 7 d bei 25 ° C.
- Bild der Zellen entweder live oder nach Immunfluoreszenzfärbung.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Bei optimalen Bedingungen werden die Zellen in der Kultur sehen mit einem runden Morphologie gesund. Die Kultur wird wenig Zelltrümmer, und 50 ~ 80% konfluente nach anfänglichen Beschichtung. Diese Zellen werden morphologische Veränderungen, nachdem sie über einen längeren Zeitraum hinweg kultiviert unterziehen. Normalerweise dauert es etwa 5-8 Tage für Zellen in der Kultur vollständig bei 25 ° C unterschieden werden Gute Qualität primären Kulturen sind in der Regel, wie gut die Zellen-of-Interest sind in der Kultur differenziert beurteilt. Zum Beispiel, primäre Muskelzellen haben oft eine Niederlassung Morphologie und werden vielkernigen Myotuben mit Streifen wie Myofibrillen, bestehend aus einer Reihe von Sarkomere. Voll differenzierte Myotuben wird in der Regel spontan in die Kultur zu bewegen. Im Gegensatz dazu bilden differenzierte primären Neuronen Cluster mit ihrem Zellkörper, und verbinden sich mit anderen Clustern mit ihrem Axon-Kabel.
Abbildung 1. Primäre Zellen durchlaufen morphologische Veränderungen, nachdem sie in der Kultur verchromt
(A) A Hellfeldbild von primären Zellen nach rechts, nachdem er in eine Vertiefung einer 384-Well-Platte ausplattiert. Die Mehrzahl der Zellen sind rund und intakt und gut voneinander getrennt. (B) A Hellfeldbild der primären Zellkultur 20 Stunden nach dem Ausplattieren. Primäre Zellen bereits Cluster bilden (große Pfeilspitze) und die Muskeln mit einer Niederlassung Morphologie (langer Pfeil) kann in diesem Stadium erkannt werden. (C) Ein Phasenkontrast-Bild der primären Kultur 5 Tage nach dem Ausplattieren. Die Kultur sieht viel weiter fortgeschritten ist, mit neuronalen Erweiterungen (kleine Pfeile), neuronale Cluster (große Pfeile) und Muskeln (mittlere Pfeil).
Abbildung 2. Beispiele für primäre Zellen mit dsRNAs behandelt in einer 384-Well-Platte kultiviert
Primäre Zellen wurden aus der Embryonen mit Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP-Transgene, in denen Dmef2-Gal4 und D42-Gal4-Laufwerk Ausdruck mito-GFP in den Muskeln und motorischen Neuronen bzw. isoliert. Die Zellen wurden mit dsRNAs gezielt entweder lacZ (AC) oder aufgeblasen (wenn) (DF) behandelt. Sowohl primäre Muskeln und Neuronen kann durch GFP (A, C, D, F) zu sehen. Die weißen Pfeile zeigen auf die neuronale Erweiterungen. Phalloidin-Färbung von Aktin (Pfeilspitzen) zeigt eine astähnlichen Muskulatur in der Kultur mit lacZ dsRNAs (B und C) behandelt, sondern Round-up Muskel-Morphologie in die Kultur mit, wenn behandelt dsRNAs (E und F). In der fusionierten Bilder (C, F), sind die Muskeln gelb gefärbt, aber rot negativen zeigt Neuronen und deren Erweiterungen (weiße Pfeile).
Abbildung 3. Konfokale Aufnahmen von primären Muskeln auf die menschliche Vitronektin-beschichteten Deckglas gleitet kultivierten
Primäre Muskeln waren immunofluorescently mit anti-Titin Drosophila (KZ) (rot in der merge) und mit Phalloidin für Aktin (grün in der Zusammenführung) gefärbt. Die Top-Panels sind die Wildtyp-Kontrolle Muskel-und Unterseite diejenigen sind die schläge (CG31374) RNAi Muskel mit verkürzten Sarkomere.
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Discussion
Die Entwicklungsmuster der primären Kulturen von Drosophila-Zellen können sehr unterschiedlich sein, was möglicherweise auf die verschiedenen Variablen während der primären Zelle Herstellungsverfahren. Zunächst fliegt zur Eiablage verwendet werden soll jungen (innerhalb einer Woche alt) und gesund (frei von viralen oder bakteriellen Infektion). Unbefruchtete oder infizierten Embryonen müssen vermieden werden, da sie nutzlos und werden die Zellen aus den Embryonen nicht unterscheiden kann und wird nur für 1-2 Tage zu überleben. Zweitens, während der Homogenisierung ist es wichtig, nicht zu überlasten den Homogenisator mit zu vielen Embryonen. Eine Überlastung der Homogenisator mit zu vielen Embryonen führt zu einem Anstieg in Höhe von Trümmern und die Zahl der toten Zellen, die schließlich Kompromiss wird der Zelldifferenzierung. Schließlich sollten die Zellen in angemessener Dichte, gute Differenzierung von primären Zellen gewährleisten beschichtet werden. Wir fanden, dass die Differenzierung der beiden Neuronen und Muskelzellen drastisch reduziert wird, wenn primäre Zellen zunächst auf eine zu hohe Dichte ausgesät werden.
Für die phänotypische Analyse werden 384-Well-Platten in der Regel verwendet, um primäre Zellen zu Screening-oder Imaging-Analyse zu einem niedrigeren Vergrößerung wachsen. Bilder mit einer viel höheren Vergrößerung und eine bessere Auflösung kann durch wachsenden Zellen auf einem Deckglas Kammer Rutsche, durch bildgebende entweder live oder gefärbten Zellen mit einem konfokalen Mikroskop verfolgt erreicht werden. Da die meisten primären Zellen adhärent sind, sollte die Fläche für den Anbau von Zellen in der auch der Kammer-Objektträgern als Leitlinie für die Schätzung der sowohl die Anzahl der Zellen und die Menge des Mediums für jedes Well benötigt werden. Darüber hinaus Deckglas Kammer-Objektträgern mit der extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine wie das humane Vitronectin beschichtet werden können, an Laminin oder Kollagen IV erlauben die Differenzierung von Zellen-of-Interest. Zum Beispiel, primären Muskeln schlecht zu unterscheiden auf der nicht-beschichteten Deckglas, sondern auch auf dem ECM-beschichteten Deckglas. Schließlich sollte, um Autofluoreszenz von Kulturmedium, die regelmäßige Kulturmedium wie Schild und Sang M3, emittiert reduzieren mit einer Fliege physiologischer Kochsalzlösung Puffer, wie HL6, kurz bevor Bildgebung ersetzt werden.
Im Prinzip kann dieses Protokoll für die Herstellung von primären Zellen aus fliegt mit jedem Genotypen, wie aus homozygot lebensfähig und fruchtbar mutierten Aktien, und von denen, deren Embryonen können manuell ausgewählt werden oder durch einen Sortierer auf die Expression von GFP basieren, verwendet werden, oder eine ausdrückliche Gewebe-spezifische Gal4, UAS-Gen X-Genotypen. In Kombination mit anderen Experimenten Methoden wird dieses Protokoll erlaubt eine Reihe von Fragen geklärt werden, insbesondere solche, die zu differenzierten Zellen wie Neuronen und Muskeln verbunden sind, und sich nur schwer in kultivierten Zelllinien in Angriff genommen werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
JB wurde von der Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716 bis 1702 unterstützt. JZ wurde durch die NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02 unterstützt. NP ist ein Ermittler des Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
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- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
