Summary
우리는에서 dissociated 기본 세포를 준비 상세한 프로토콜을 제공합니다
Abstract
여기 Drosophila gastrula의 배아에서 dissociated을 준비하고 culturing 기본 세포에 대한 방법을 설명합니다. 간단한에서는 많은 양의 젊고 건강한 파리에서 배아를 개최는 수집 소독 및 유리 균질 화기를 사용하여 단일 세포 현탁액에 다음 물리적 dissociated 있습니다. 문화 매체에 적절한 밀도에 문화 접시 또는 챔버 슬라이드에 도금 후,이 세포가 추가로 특정 세포 마커에 의해 확인할 수 있습니다 몇 가지 morphologically - 서로 다른 세포 유형으로 구별하실 수 있습니다. 또한, 우리는 유전자 최저를 이끌어내는 두 번 좌초 (DS) RNAS 이러한 세포를 치료에 대한 조건을 제시한다. Drosophila 차 전지의 효율적인 RNAi는 dsRNA 간단하게 함유 배지에서 세포를 입욕에 의해 수행됩니다. 다른 분자, 생화학, 세포 이미징 분석과 함께 효과적인 RNAi의 섭동을 수행하는 능력은 질문의 다양한 특히 Drosophila 차 전지, 차별화된 근육 세포의 연결에 관련된 사람에 답변 수 있습니다.
Protocol
1. 파리 케이지의 준비
- 같은 32 온스의 곤충 컵 등 편리한 용기 Drosophila (예 : 오레곤 - R 또는 유전자형과 같은 야생 형 변종) 성장.
- 대형 배아 - 수집 연습장 새로 eclosed 파리를 전송하거나 인구 새장을 날아.
- ~ 25의 온도와 공간에 새장을 이동 ° C 습도 65 ~ 12 H 비추어 %와 동기식 태아의 수집을 용이하게하기 위해 검은 12 H 사이클.
- 그들 몰레 시즈 접시에 줄무늬 효모 붙여넣기를 죽인 먹이로 새장에 파리를 유지합니다. 2-3를위한 하루에 한 번 당밀 번호판을 (죽은 효모 붙여넣기)를 변경 D.
2. 동기 배아 수집
- 기본 셀 준비의 날, 1-2 H 미리 누워 기간 동안 붙여 살해 효모와 코팅 파리 wth 새로운 번호판을 공급.
- 단지 12 - H 어두운주기 전에 효모 붙여넣기의 최소 금액과 함께 줄무늬 신선한 당밀 플레이트와 함께 사전에 누워 접시를 교체하십시오. 비동기 이전 배아를 포함하는 사전 누워 컬렉션을 폐기.
- 1-2 H. 기간 동안 태아를 수집
- 5-6 H. 25에서 배아와 저장소의 비교적 동기 인구를 포함하는 접시 ° C를 제거 배아 이번에 고급 gastrula 무대에있을 것입니다.
3. 수집 및 배아의 세척
- 배아는 하단에있는 최고급 메쉬 체에서 수집하므로, 젖은 페인트와 함께 접시에서 배아를 풀어, 그리고 sieves의 스택 집합을 통해 미지근한 수돗물로 깨끗이 씻어. 가능한 한 많은 효모 및 비행 파편으로 제거하는 몇 분 동안 씻어.
- 팁 배아는 한쪽에 축적되도록 sieves, 그리고 부드럽게 dechorionation 바구니에 체에서 그들을 씻어.
- 배아가 건조 아무말도없이 조직 문화 후드 영역으로 이동합니다.
4. 배아의 균질화 및 세포의 도금
- 소독 50 % (권 / 권) 50-10 분 표백제에서 그들을 immersing하여 배아를 dechorionate. 70% (권 / 권) 에탄올과 바구니의 벽에서 배아를 씻어. 또는 에탄올 치료를 받기 전에 증류수로 배아에서 표백제를 씻어. 이 시점에서 온워드 배아는 무균 조건과 조직 문화 후드에서 처리되어야합니다.
- autoclaved 증류수와 표백제 및 / 또는 에탄올을 제거 철저하게 배아를 씻어.
- dechorionation 단계 동안, 태아의 크기에 따라 실내 온도 M3 매체의 적절한 볼륨 다운스의 균질 화기를 입력하십시오. 배아의 볼륨 사이와 미디어의 비율은 0.5 - ML 배아 이상해서는 안됩니다 : 40 - ML 미디어 (또는 ~ 100-200 배아 / ML).
- 잠수함 배아를 충분히 M3 미디어의 금액과 소독을 비커에 씻어서 배아를 놓습니다. 배아는 2-5 분 흠뻑 젖어 보자.
- dechorionation 바구니를 분해하고 소독을 종이 타월로 Nitex 메쉬가 건조 얼룩.
- 멸균 페인트로 균질 화기로 배아를 전송합니다.
- 모든 배아가 일시 중지 때까지 튜브의 바닥에 도달하지 않고 느슨한 유봉을 사용하여 짧은 스트로크와 함께 부드럽게 균질. 부드럽게,하지만 단호하게, 여덟 전체 스트로크와 균질. 그것이 아래로 이동하고 같은 유봉을 비꼬아하지 마십시오.
- 용탕 주입이나 pipetting을 통해 살균 50 ML 원뿔 원심 튜브에 homogenate를 전송하고, 튜브 캡.
- 40g, 펠렛을 실온 조직 파편, 큰 세포 대단히 짧은 시간과 vitelline의 점막에서 10 분 원심 분리기. 깨끗한 튜브에 세포와 노른자가 들어있는 뜨는을 전송 5 분 원심 분리 단계를 반복합니다.
- 세포를 따르고 또는 펠렛으로, 360g 10 분 깨끗한 튜브와 스핀으로 실내 온도를 pipetting하여 표면에 뜨는를 주의깊게 전송합니다. 뜨는 폐기하십시오. 문화 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 (RNAi 실험을위한 혈청 무료 중간) Resuspend.
- 세포 밀도를 추정 hemocytometer를 사용하여 가능한 셀을 계산합니다. 한편, 펠렛 세포에 4.10 단계를 반복합니다.
- 원하는 농도로 세포를 Resuspend. 시작하려면 1의 범위 ~ 5 X10 6 셀 / ML 및 1.7-2.5 X10 5 셀 / cm 2 판 밖으로보십시오.
5. 384 잘 접시에 성장 세포에 대한 기본 셀 RNAi
- 384 잘 플레이트에 잘 당 ~ 250 NG의 최종 농도 각 우물에 dsRNAs 5 μl를 분배.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각 우물에 다른 dsRNA를 포함하는 384 잘 플레이트에 혈청 무료 M3 매체에 잘 따라 기본 셀 10 ML (1 ~ 4x106 세포 / ML)를 분배. 또한, 전지가 공촛점 이미징 8 - 음 유리 챔버 슬라이드에서 교양 수 있습니다.
- 300g, 실온에서 1 분 번호판을 원심 분리기. 25 혈청없는 매체 문화 세포 ° 22 H 또는 18 ° C 1-2위한 C D.
- 각 잘하는 혈청 함유 배지 30 ML을 추가합니다. 300g, 실온에서 1 분 번호판을 원심 분리기.
- ~ 7 D 25 추가 5 습기 챔버 문화 기본 세포 ° C.에 접시를 놓고
- 이미지 세포도 살지 immunofluorescence 염색법 후.
6. 대표 결과 :
최적의 조건에서, 문화에있는 세포 둥근 형태로 건강을 찾습니다. 문화 작은 세포 파편을 가지고 있고, 초기 도금 후 50 ~ 80 % 합류한다. 이러한 세포는 오랜 기간 동안 교양 후 형태학의 변화를 받아야합니다. 그것은 일반적으로 완벽하게 25 차별하는 문화의 세포 약 5~8일 소요 ° C. 좋은 품질의 차 문화는 일반적으로 세포 수준의 관심이 문화에 차별하는 방법 잘으로 판단됩니다. 예를 들어, 기본 근육 세포들은 종종 지점과 같은 형태를하고 sarcomeres 일련의 구성 myofibrils 같은 줄무늬가있는 multinucleated myotubes된다. 완전 차별 myotubes은 대개 저절로 문화에 이동합니다. 대조적으로, 차별화된 기본 뉴런들은 세포 기관과 클러스터를 형성하고, 그들의 축삭 케이블 다른 클러스터와 연결합니다.
그림 1. 기본 세포는 문화에 도금 후 morphologic 변경 사항을 받다
오른쪽 384 잘 판의 우물에 도금 후 기본 셀 (A) 명시야 이미지. 세포의 대부분은 원형 그대로 잘 구분됩니다. 기본 세포 배양의 (B) 명시야 이미지 20시간 도금 후. 차 전지는 이미 지점과 같은 형태 (긴 화살표)와 클러스터 (큰 애로)와 근육이 단계에서 인식 수를 형성하고 있습니다. 오일 도금 후 주요 문화 (C) 위상 대비 영상. 문화의 연결을 확장 (작은 화살표)의 연결을 클러스터 (대형 화살촉)와 근육 (중소 화살표)와 함께 더 많은 고급 보인다.
그림 2. dsRNAs 취급 차 전지의 예 384 잘 판에 교양
차 전지는 Dmef2 - Gal4 들고 배아, D42 - Gal4, UAS - 미토 - GFP의 transgenes,하는 Dmef2 - Gal4 및 근육과 운동 신경에 미토 - GFP의 D42 - Gal4 드라이브 표현, 각각에서 고립되었다. 세포 lacZ (AC) 또는 비정상적으로 증가 (경우) (DF) 중 하나를 대상으로 dsRNAs로 치료했다. 주요 근육과 신경 모두 GFP (A, C, D, F)로 볼 수 있습니다. 흰색 화살표의 연결을 확장을 가리 킵니다. 굴지 (화살촉)의 Phalloidin의 얼룩은 lacZ dsRNAs (B와 C) 대우 문화에 지점과 같은 근육 구조를 공개하지만, 문화에 라운드 - 업 근육 형태가있다면 함께 치료 dsRNAs (E와 F). 병합된 이미지 (C, F)에서 근육이 노란색 스테인드지만, 붉은 부정적인 쇼 뉴런과 확장 (흰색 화살표). 아르
그림 3. 주요 근육의 공촛점 micrographs 인간 vitronectin - 코팅 커버 유리 슬라이드에 교양
주요 근육은 immunofluorescently 방지 Drosophila Titin (KZ) (병합에 빨간색)과 굴지에 대한 phalloidin (병합에 녹색) 물들일되었습니다. 상단 패널은 야생 형 제어 근육이며, 아래 것들 살스 (CG31374) 단축 sarcomeres와 RNAi의 근육입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila 세포의 주요 문화의 발달 패턴은 크게 기본 셀 준비 과정에서 여러 변수에 따라 가능 다를 수 있습니다. 우선, 달걀 부설에 사용되는 파리 젊은이가 (이전 일주일 이내)과 건강 (바이러스 또는 세균 감염은 무료). 있어야 그들이 쓸모 있고 그 배아에서 추출한 세포가 구별 수없는 오직 1~2일 위해 살아남을 것이다로 Unfertilized 또는 감염된 태아는 피해야한다. 둘째, 균질화 과정에서, 그것은 너무 많은 배아와 과부하 균 질기를하는 것이 중요합니다. 너무 많은 배아와 균 질기를 오버로드하면 부스러기 결국 세포 분화를 손상됩니다 죽은 세포의 숫자의 양을 증가의 원인이됩니다. 마지막으로, 세포는 세포의 기본 좋은 차별을 보장하기 위해 적절한 밀도로 도금한다. 우리는 기본 세포가 너무 높은 밀도에서 처음 씨앗을 때 뉴런과 근육 세포 모두의 분화가 급격하게 감소되고있는 것으로 나타났습니다.
phenotypic 분석을 위해, 384 잘 접시는 일반적으로 낮은 배율에서 심사 또는 이미지 분석을위한 기본 세포를 성장하는 데 사용됩니다. 보다 높은 배율과 좋은 해상도와 이미지가 공촛점 현미경을 사용하여 영상 라이브 또는 스테인드 세포에 의해 다음 커버 - 유리 챔버 슬라이드에 성장 세포에 의해 얻을 수 있습니다. 대부분의 일차 세포가 자기편 있으므로, 실내 슬라이드 우물에 성장하는 세포를위한 지역이 세포의 수와 각 물론 필요한 매체의 금액을 모두 평가를위한 지침으로 사용해야합니다. 또한, 커버 - 유리 챔버 슬라이드가 같은 인간 vitronectin과 같은 세포외 기질 (ECM) 단백질로 코팅 수 있습니다 laminin 또는 콜라겐 IV는 세포 수준의 관심의 분화를 허용합니다. 예를 들어, 기본 근육뿐만 ECM - 코팅 커버 - 유리, 비 코팅 커버 - 유리에 제대로 구분. 마지막으로, 문화 미디어, 방패 상 M3와 같은 일반 배지에서 방출 autofluorescence을 줄이기 위해 바로 이미징 전에 같은 HL6로 날아 생리 생리 버퍼,로 대체해야합니다.
원칙적으로,이 프로토콜은 같은 homozygous 가능한와 비옥한 돌연변이 주식에서 같은 genotypes, 함께 날아로부터 그의 배아 GFP의 표현에 따라 다소 수동으로 선택하거나 수있는 사람의 기본 세포의 준비에 사용하거나 표현할 수 있습니다 조직 특정 Gal4, UAS - 유전자 X의 genotypes. 다른 실험 방법과 함께,이 프로토콜은 질문 다양한 해결 수 있도록, 특히 신경 및 근육 등 차별화된 세포와 관련된 이들과 교양 세포 라인에 달려드는 수 어렵습니다 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
JB는 데몬 런연 암 연구 재단 원정대 DRG - 1716-02에 의해 지원되었다. 점프 온 제로는 NIH / NIGMS 원정대 F32 GM082174 - 02에 의해 지원되었다. NP는 하워드 휴즈 의학 연구소의 수사관이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
