Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

Summary

פרוטוקול זה מתאר את נוהל מפורט עבור cryopreserving אדם בתאי iPS במדיום בנוקאאוט SR cryopreservation ושחזור אלה תאים להשלים בנוקאאוט SR מזין חינם (KSR-FF) בינוני או מבוססי מזין בנוקאאוט בינוני SR.

Abstract

הגילוי בשנת 2006 כי fibroblasts האדם העכבר יכול להיות reprogrammed כדי לייצר תאים iPS ^1-3 עם איכויות דומות להפליא בתאי גזע עובריים יצרה מקור חדש בעל ערך של תאים pluripotent עבור גילוי תרופות, טיפול בתא, ואת המחקר הבסיסי.

התקשורת GIBCO ו ריאגנטים להיות בחוד החנית של המחקר תא גזע pluripotent במשך שנים. נוק DMEM בתוספת החלפת נוק סרום הוא התקשורת המועדף על צמיחת תאים גזע עובריים ועכשיו iPS תרבית תאים ^3-9. מערכת זו תקן הזהב לתקשורת כעת ניתן להשתמש עבור תרבות חופשית מזין עם תוספת של SR קוקטייל נוק גורם הגדילה.

ES האדם מסורתית ותרבות iPS שיטות תא דורשים שימוש בעכבר או אדם מזין שכבות פיברובלסטים, או מזין ממוזג בינוני. שיטות אלה הם תרבות עתירי עבודה, קשה בקנה מידה וקשה לשמור על הירכיים תאים שלא עברו התמיינות בשל תנאים מוגדרים. Invitrogen פיתחה SR נוק צמיחה קוקטייל פקטור כדי לאפשר לך מעבר בקלות הירכיים ותרבויות הס תא מזין חופשית תוך שמירה על השימוש שלך SR נוק.

Protocol

הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים תרבות, כל ההליכים פרוטוקול זה מבוצעות באמצעות שיטות מעבדה סטרילית שנערך מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.

לפני שמתחילים, להבטיח כי התקשורת היא כל equilibrated ל 37 ° C ו בגז כראוי.

הכנת Geltrex מצופה צלחות תרבות

הערה: ראה נספח לשימוש CELLstart מנות תרבות מצופה.

1. One הפשירי שפופרת של Geltrex (1 מ"ל) לאט 2-8 ° C ו 1:100 לדלל אותו 99 מ"ל של נוק D-MEM/F-12. מערבבים בעדינות את הפתרון.
   
   הערה: יש שורות תאים iPS עשויה לדרוש דילול שונים Geltrex לצמיחה אופטימלית. ראו נספח דילולים חלופיים.
2. מכסים את כל פני השטח של כל מנה תרבות עם פתרון Geltrex (1 מ"ל למנה 35 מ"מ, 1.5 מ"ל למנה 60 מ"מ).
3. חותם כל צלחת עם Parafilm כדי למנוע ייבוש דגירה את הכלים במשך שעה 1 ב 37 ° C.
   
   הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את Geltrex מצופה מנות התרבות בשעה 4 ° C עד חודש 1. חותם כל צלחת עם Parafilm למנוע Geltrex מהתייבשות.
4. לפני השימוש, העברת Geltrex מצופה הכלים ברדס זרימה למינרית ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ - 1 שעה).

הכנת בנוקאאוט השלם SR מזין ללא בינוני

1. כדי להכין 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון בסיסי FGF, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C למשך עד 6 חודשים.
   

   יסוד FGF	10 מיקרוגרם
   D-PBS	990μL
   10% BSA	10 μL

   
   הערה: ניתן להחליף BSA עם HSA או SR נוק בריכוז זהה.
2. כדי להכין 50 מ"ל של תמיסת מ"ג / מ"ל ​​2 Dispase, בסביבה נקייה מחיידקים, לערבב את המרכיבים המפורטים להלן. סנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.

   Dispase	100 מ"ג
   D-PBS	50 מ"ל

3. כדי להכין 100 מ"ל של SR בנוקאאוט להשלים מזין חינם (KSR-FF) בסביבה נקייה מחיידקים, לשלב את המרכיבים המפורטים בטבלה להלן.
   

   רכיב	במלאי ריכוז	הריכוז הסופי	נפח
   נוק DMEM/F12 (לא קט. 12660-012)	-	1X	76.8 מ"ל
   GlutaMAX-I (קט 'מס' 35050-061)	200 מ"מ	2 מ"מ	1 מ"ל
   נוקאאוט SR (לא קט. 10828-028)	-	20%	20 מ"ל
   נוקאאוט SR-GFC (לא קט. A10580-01)	50X	1X	2 מ"ל
   bFGF (לא קט. PHG0024).	10 מיקרוגרם / מ"ל	20 ng / mL	200 μL

   
   אתה יכול לאחסן את המדיום KSR-FF ב 2-8 מעלות עד שבוע.
4. רגע לפני טרום equilibrating המדיום להשלים לטמפרטורה וגזים, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף נפח הנדרש mercaptoethanol 2 (55 מניות בריכוז mM) בריכוז סופי 0.1 מ"מ. לדוגמה, כדי להכין 100 מ"ל של KSR-Fבינוני F להוסיף μL 182 מ"מ 55 2 mercaptoethanol (1:550 דילול) לחילופין, 2 mercaptoethanol ניתן להוסיף בינוני השלימה 1X ומאוחסנים ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע.

הכנת הקפאה / cryopreservation בינוני

בינוני cryopreservation מורכב משני התקשורת; בינוני מקפיא A ו-B בינוני הקפאת הם הוסיפו לתאים בזמנים שונים חייבים להישאר מופרדים. הם כל אחד 50% מהנפח הכולל של בינונית cryopreservation הצורך. סך היקף בינוני cryopreservation שצריך הוא 1 מ"ל על כל בקבוקון להיות קפוא. צלחת 90% 60mm ומחוברות של hESC יכול לשמש לבנק 2 בקבוקונים של hESC בתקשורת cryopreservation.

הכן נפח מספיק בינונית כל הקפאה עם תוספת 2-5 מ"ל כדי להבטיח overage.

בינוני הקפאה (50% של נפח סופי):	50% DMEM/F12	50% KSR
בינוני B מקפיא (50% של נפח סופי):	80% DMEM/F12	20% DMSO

דוגמה:

אם אתה מקפיא 20 בקבוקונים של תאים, תצטרך 20mL של cryopreservation בינוני. הוסף 4mL עבור overage עבור סכום כולל של בינונית cryopreservation 24mL. כלומר, תצטרך 12mL של הקפאת בינוני (50% 24mL) ו 12mL של B בינוני הקפאה (50% 24mL).

בינוני הקפאה (12 מ"ל):	6 מ"ל DMEM/F12	6 מ"ל KSR
בינוני B מקפיא (12 מ"ל):	9.6 מ"ל DMEM/F12	2.4 מ"ל DMSO

ההרכב הסופי של המדיום cryopreservation הוא 65% DMEM/F12, KSR 25% ו 10% DMSO.

Cryopreserving iPSCs

1. טרום חם נפח הנדרש Dispase בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס. עיין טבלה 1 להלן פרטים על כרכים הנדרש.
2. טרום לאזן את נפח הנדרש KSR-FF תוך 37 דק 'for15 ° C אמבט מים. עיין 1below טבלה לקבל פרטים על אמצעי האחסון הנדרש.
3. לשאוב את המדיום בילה מספינת תרבות באמצעות פיפטה, ולשטוף את התאים פעמיים עם D-PBS.
4. בעדינות להוסיף מראש חימם פתרון Dispase לכלי השיט תרבות (למשל, 1 מ"ל של תמיסת Dispase לכל צלחת 60 מ"מ תרבות). מערבולת כלי התרבות כדי לצפות את פני התא כולו.
5. דגירה כלי התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
6. הסר את כלי מן האינקובטור, לשאוב את הפתרון Dispase, לשטוף בעדינות את התאים עם D-PBS.
7. בעדינות לגרד את התאים את פני השטח של צלחת התרבות באמצעות מגרד התא, ולהעביר את התאים צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל.
8. יש לשטוף את המנה תרבות פעמיים עם KSR-FF, בעדינות "ריסוס את" כל התאים לא מנותקת. בריכת בינוני לשטוף עם התאים בצינור 15 מ"ל.
9. צנטריפוגה התחתית XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
10. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה וזורקים אותו.
11. הכינו כמות מספקת של cryovials. ברגע שהתאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות.
12. קפיצי בעדינות את הצינור, באופן מלא לעקור את התא גלולה מתחתית הצינור מחדש להשעות את התאים א בינוני מקפיא [על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות 5 מ"ל סרולוגיות פיפטה]. בעקבות השעיה אחיד של גושים, מוסיפים נפח שווה של B בינוני מקפיא אליו, בצורה טיפה חכם, בעוד בעדינות מתערבל ההשעיה תא לערבב.
    
    הערה: בשלב זה, התאים נמצאים בקשר עם DMSO, עבודה חייב להתבצע ביעילות. לאחר התאים נמצאים בקשר עם DMSO, הם צריכים להיות aliquoted קפואים בתוך 2-3 דקות.
13. Aliquot 1 מ"ל של השעיה על התא cryovial כל אחד.
14. במהירות למקום בקבוקונים ב פרוסטי מר [במהירות להקפיא] ולהעביר אותו -80 מעלות למשך הלילה.
15. לאחר אחסון ולינה -80 ° C, להעביר את התאים מיכל חנקן נוזלי לצורך אחסון לטווח ארוך.

iPSC להפשיר בקבוקון והתאוששות תא

הערה: KSR-FF עשוי להיות מוחלף עם המדיום MEF ממוזג KSR המכילים, או בינוני KSR לשימוש עם המאכיל. ראו נספח הוראות להכנת אמצעי התקשורת.

טרום חמים 10 מ"ל של מדיום KSR-FF בתוך שפופרת 50 מ"ל.

1. לאזן את הכמות המתאימה של Geltrex מצופה הכלים בטמפרטורת החדר לשאוב כל נוזל הכלים לפני ציפוי אותךr תאים.
2. הסר בזהירות את hESC (או iPSC) בקבוקון מטנק חנקן נוזלי אחסון.
3. בקבוקון קפוא להפשיר במהירות של תאים אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים, רק עד נתח קפוא קטן נשאר הבקבוקון.
4. תרסיס בקבוקון עם 70% isopropanol כדי לטהר אותו ולהעביר אותו את מכסה המנוע רקמה סטרילית תרבות.
5. בסביבה נקייה מחיידקים, להעביר את כל תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל.
6. יש לשטוף את הבקבוקון עם 1 מ"ל של KSR-FF ולהוסיף את זה צינור 15 צנטריפוגות מ"ל.
7. לאט לאט, להוסיף 4 מ"ל של KSR-FF נפתח חכם התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. בעוד הוספת בינוני, בעדינות להזיז את הצינור הלוך ושוב לערבב את התאים. (פעולה זו מפחיתה את הלם אוסמוטי על התאים).
8. צנטריפוגה שפופרת 15 מ"ל עם ההשעיה התא 1000rpm (200 x ז) ​​למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
9. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant מבלי להפריע לתא גלולה.
10. Re-להשעות את התא גלולה מראש חימם KSR-FF (למשל 4mL/60 צלחת מ"מ) בעזרת פיפטה 5 מ"ל פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה עד התא גלולה מפוזרת באופן מלא. הכדאיות של יותר מ 70% צפויה, אולם אם הכדאיות הוא פחות מ -70%, זה עלול לקחת זמן רב יותר עבור התאים להגיע למפגש.
11. בעזרת פיפטה אותו, להעביר את ההשעיה תא נפתח חכם צלחת Geltrex מצופה תרבות טרום equilibrated לטמפרטורת החדר.
12. מניחים את צלחת תרבות 37 ° C חממה, עם אווירה humidified של CO 4-6% ₂ באוויר. בזהירות מערבולת כלי בצפון לדרום, ממזרח למערב דפוס כדי לפזר באופן שווה את התאים.
13. בעדינות נוזל לשנות את המנה תרבות 24 שעות לאחר ההפשרה ואת יום לאחר מכן להסיר את פסולת התא כדי לספק מזון טרי עד המנה הוא כ 70-80% ומחוברות. עבור התרבות המשך passaging של תאים iPS שלך, עיין בפרוטוקול שלנו תחת הכותרת "מזין ללא התרבות Passaging של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם החלפת סרום מזין ללא בינוני"

תוצאות צפויות

התאים צריכים להיות בערך 70-80% ומחוברות לפני cryopreservation. Dispase תוצאות עיכול להתכרבל מתקפלים המושבות בשולי המושבה. לאחר קצירת התאים הם קפואים כמו גושים קטנים בתקשורת cryopreservation. לאחר הבקבוקון הוא מופשר, תאים להתאושש לצרף צלחת מצופה מראש כמו גושים קטנים. הם גדלים במהירות המוביל צלחת ומחוברות בתוך 5-6 ימים.

לוח 1 - כרכים מומלצים

רכיב	35mm דיש	60mm דיש	100mm דיש
השלם בנוקאאוט SR בינוני	2 מ"ל	4 מ"ל	10 מ"ל
Geltrex פתרון	1 מ"ל	1.5 מ"ל	4-5 מ"ל
Dispase	0.5 מ"ל	1 מ"ל	3-4 מ"ל
D-PBS עבור שטיפה	2 מ"ל	4 מ"ל	10 מ"ל

אנא לחץ כאן כדי לראות את התוספתן .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials