Summary
कीड़ों में, oenocytes cuticular हाइड्रोकार्बन यौगिकों का उत्पादन. इन यौगिकों desiccation के खिलाफ की रक्षा और रासायनिक संचार की सुविधा. यहाँ हम एक विच्छेदन के लिए वयस्क से oenocytes अलग तकनीक का इस्तेमाल का प्रदर्शन
Abstract
में
Protocol
भाग 1. वयस्क ड्रोसोफिला पेट की पट्टिका तैयारी.
प्रक्रिया उल्लिखित oenocytes हटाने के बाद (प्रोटोकॉल का part2 देखें) के लिए नीचे तत्काल पेट तैयार. एक ही प्रक्रिया भी छल्ली के भीतरी सतह से जुड़ी अन्य पृष्ठीय (यानी दिल) पोत और वसा शरीर के ऊतकों, सहित की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
ध्यान दें कि वीडियो लेख में oenocyte विच्छेदन तकनीक एक वयस्क जंगली प्रकार (केण्टन एस) नर मक्खी, उम्र के छह दिनों के प्रदर्शन पर है. समान तकनीक महिला मक्खियों से oenocytes हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पेट पट्टिका तैयारी में लगभग 5 मिनट के लिए प्रदर्शन लगते हैं.
शुरू करने से पहले यह महत्वपूर्ण है के लिए तैयार कई विच्छेदन ठीक पिंस (नीचे देखें और भाग 2) और एक विच्छेदन सुई (पार्ट 2 देखें). व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विच्छेदन काँटों अक्सर इस प्रोटोकॉल के लिए बहुत बड़ी है, तो हम प्रयोगशाला में हमारे खुद fabricating करने के लिए ले लिया है. विच्छेदन सुई बनाने के लिए, टंगस्टन का तार (.005 ") पहले चमड़े के नीचे सुई के शाफ्ट (27G, एल्यूमीनियम हब) के माध्यम से लड़ी पिरोया है धागा. तार चमड़े के नीचे सुई की नोक के माध्यम से इतना है कि यह हब से उभर उभड़नेवाला तार समेटना केंद्र से, इस चमड़े के नीचे सुई के बाहर निकाला जा रहा से तार अगला रोकता है, ऐसे समेटना है कि तार के कई मिलीमीटर (~ 3 4mm) चमड़े के नीचे सुई की नोक से बहर के विपरीत अंत में तार काट पासिंग. एक लौ के माध्यम से उजागर टंगस्टन का टिप एक बहुत ठीक बात करने के लिए तार पैनापन एक डिस्पोजेबल 5ml प्लास्टिक विंदुक जब चमड़े के नीचे सुई के केंद्र में अंकित इस विच्छेदन उपकरण के लिए सुविधाजनक संभाल के रूप में कार्य करता है. जाएगा. ठीक विच्छेदन पिंस में एक समान बना रहे हैं तरीका है. sharpening कदम के बाद, संदंश के साथ मजबूती से तार की बहुत टिप समझ बढ़ने से रोकने के लिए और एक कट से टिप लगभग 3mm छोटे विच्छेदन पिन रिलीज. देखभाल का उपयोग करने के लिए किया जा रहा है की समझ से दराज से पिन को रोकने के संदंश.
पट्टिका के लिए वयस्क ड्रोसोफिला पेट तैयार:
- छाती हालांकि ठीक विच्छेदन पिन रखकर; विच्छेदन प्लेट (डॉव Corning Sylgard) के लिए उड़ान भरने को सुरक्षित करो.
- मक्खी के पैर और पंख निकालें. जबकि पैरों के सबसे पीछे सेट को हटाने, बस जहां छाती पेट मिलता पूर्वकाल बिंदु पर छल्ली में एक खोलने बनाएँ. इस उद्घाटन के बाद पेट के ventral सतह के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक पहुँच बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है (देखें चरण 5)
- जननांग खंड के माध्यम से एक दूसरे विच्छेदन पिन रखकर जगह में उड़ान भरने के पेट सुरक्षित.
- ठंडा ढाल के साथ उड़ कवर और एम 3 कीट मध्यम (सिग्मा) गाया. यह एक पाश्चर विंदुक के साथ बंद ड्राइंग द्वारा किसी भी फंस हवा निकालें.
- का उपयोग संदंश जननांग सेगमेंट पैरों को हटाने के द्वारा बनाई गई छल्ली में खोलने से उदर midline के साथ एक चीरा द्वारा पेट खुला. हिम्मत और पेट से gonads निकालें.
- छल्ली और tracheae छाती पेट को जोड़ने तोड़. केवल शेष छाती पेट को जोड़ने ऊतक दिल होना चाहिए. यह कुछ स्थिरता के साथ पेट छल्ली प्रदान करता है, और यह घूर्णन या अगले कदम के दौरान घुमा से रोकता है.
- फ्लैट पिन पेट छल्ली के पूर्वकाल सबसे कोनों. छाती निकालें. तना हुआ, पिन छल्ली के फ्लैट पीछे कोनों छल्ली पुलिंग. जननांग खंड में पिन करने के लिए छल्ली फ्लैट में रखे repositioned किया जा आवश्यकता हो सकती है.
भाग 2. Oenocyte विच्छेदन
पेट पट्टिका तैयारी पेट छल्ली दिल, वसा शरीर, tracheae, शरीर दीवार मांसपेशियों, epidermis, और oenocytes सहित संलग्न ऊतकों की आंतरिक सतह को उजागर. दिल पृष्ठीय midline के साथ निहित है. फैट शरीर (अपारदर्शी ऊतक) आंतरिक cuticular सतह के सबसे शामिल हैं. Tracheae (सफेद ट्यूबलर संरचना) पार्श्व झरोखा खुलने से विस्तार, और व्यापक शाखाओं जो इन ऊतकों में घुसपैठ कर. इन ऊतकों के नीचे झूठ बोलना, pigmented (कोशिकाओं एम्बर रंग) oenocytes midline से प्रत्येक खंड के पीछे क्षेत्र में छल्ली के पार्श्व किनारे करने के लिए विकीर्ण. oenocytes प्रत्येक tergite (पृष्ठीय cuticular प्लेट) के अंधेरे में tanned क्षेत्रों के नीचे सीधे झूठ और उनके स्थान के पूर्व ज्ञान के बिना पहचान मुश्किल हो सकता है. Ventrally स्थित oenocytes के एक अन्य आबादी sternites (उदर cuticular प्लेटें) के साथ जुड़ा हुआ है, हालांकि यह संभव है इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए, इस वीडियो प्रोटोकॉल केवल पृष्ठीय oenocytes के विच्छेदन प्रदर्शन करेंगे. प्रत्येक पेट खंड में, वसा शरीर के ऊतकों की एक प्रमुख पत्ता oenocytes के लिए पूर्वकाल निहित है, एक छोटे वसा शरीर के कम स्पष्ट पत्ता oenocytes के लिए पीछे निहित है. वसा शरीर के ऊतकों के प्रमुख पत्ता अक्सर oenocyte को शामिल किया गयायह पूर्ववर्ती खंड के एस. पृष्ठीय पोत और वसा शरीर पहले हटा दिया जाना चाहिए क्रम में oenocytes बेनकाब है.
यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि oenocytes के एम्बर pigmentation, जिसमें से अपने नाम व्युत्पन्न (oeno - oînos से यूनानी, 'शराब') 1, स्पष्ट रूप से आसपास के ऊतकों से इन कोशिकाओं को अलग, pigmentation की तीव्रता उम्र के साथ बढ़ता मक्खी के. इसके अलावा, एक बेसल लामिना 2,3 oenocytes ensheathes, सेल समूहों के लिए समर्थन प्रदान और विच्छेदन के दौरान अलग बनने से कोशिकाओं को रोकने . बेसल लामिना भी extraneously पालन ऊतकों के हटाने में वसा शरीर के ऊतकों के रूप में में, एक कमजोर बिंदु है जहां इन adhesions आसानी से बाधित हो सकता है है बनाने के द्वारा, एड्स.
नीचे दिये की प्रक्रिया पेट आवरण से oenocytes को हटाने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है. oenocytes पेट 2-5 (पुरुष), क्षेत्रों, और 2-6 (महिला) से आसानी से हटाया जा सकता है. पहली और आखिरी पेट खंड (1 क्षेत्रों, और एक या पुरुषों में 6 7 महिलाओं में) से oenocytes अक्सर विच्छेदन छल्ली के कोनों पकड़े पिन द्वारा बाधित कर रहे हैं और इसलिए परहेज कर रहे हैं. oenocytes को हटाने में लगभग 10 मिनट के लिए प्रदर्शन लगते हैं.
वयस्क oenocytes को अलग करने के लिए:
- Tracheal एक विच्छेदन सुई का उपयोग spiracles से निकलती सामान तोड़.
- एक विच्छेदन सुई के साथ छल्ली के भीतरी सतह को कनेक्शन विच्छेद करके वसा शरीर और दिल निकालें. ऐसा करने के लिए, वसा शरीर और oenocytes बीच विच्छेदन सुई के बिंदु की स्थिति, और छल्ली के पार्श्व किनारे से खींचें, midline के माध्यम से, दिल के नीचे चलती है, और विपरीत पक्ष के लिए जारी है. पीछे से पूर्वकाल के लिए प्रगति, वसा शरीर और एक के बाद एक खंड की छल्ली से हृदय के ऊतकों को हटा दें. अगर ध्यान से प्रदर्शन oenocytes छल्ली के लिए संलग्न रहते हैं, और वसा शरीर और दिल पूरी हटाया जा सकता है.
- शारीरिक दीवार मांसपेशियों पट्टा छल्ली के भीतरी सतह को oenocytes. विच्छेदन सुई का प्रयोग प्रत्येक खंड के अनुदैर्ध्य शरीर दीवार मांसपेशियों तोड़. ऐसा करने के लिए, oenocyte भूग्रस्त के पीछे पक्ष के साथ विच्छेदन सुई खींचें, धीरे उन्हें छल्ली की सतह से उठाने. रिबन की तरह oenocyte किस्में छल्ली दूर से आते हैं और पक्ष को रखा जा सकता है, जबकि शेष oenocytes हटा रहे हैं चाहिए.
- एक बार छल्ली से हटा दिया है और विच्छेदन प्लेट पर झूठ बोल रही है यह आवश्यक हो के लिए रवाना हो साफ हो सकता है किसी भी oenocytes से वसा शरीर के ऊतकों का पालन है. यह बस वसा शरीर के ऊतकों और oenocytes के बीच विच्छेदन सुई दे, और सुई नीचे और विच्छेदन की थाली के खिलाफ धकेलने के द्वारा कनेक्शन विच्छेद के द्वारा किया जाता है.
- बस उन्हें विच्छेदन सुई के अंत के साथ poking द्वारा oenocyte किस्में को इकट्ठा करो. एक बार विच्छेदन सुई oenocytes मध्यम संस्कृति के सतह भर में धीरे से खींच कर सकते हैं के अंत करने के लिए अटक. dissected oenocytes सेल lysis या तो शाही सेना या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपयुक्त बफर में सीधे रखा जा सकता है. ध्यान दें कि एक एकल पुरुष मक्खी से oenocytes (पेट खंडों 2-5) आम तौर पर कुल शाही सेना के 15 20ng पैदावार.
चित्रा लिजेंड:
चित्रा 1. Desaturase जीन, डी. के पुरुष और महिला oenocytes में desat1 और desatF की अभिव्यक्ति मेलानोगास्टर सीडीएनए से रिवर्स प्रतिलेखन-पीसीआर प्रवर्धन desat1 और desatF के वयस्क पुरुष और महिला oenocytes से व्युत्पन्न. desat1 जीन पुरुष और महिला दोनों oenocytes में व्यक्त की है; desatF अभिव्यक्ति यौन dimorphic है, महिला oenocytes में विशेष रूप से व्यक्त किया जा रहा है. जीन अभिव्यक्ति में इन मतभेदों के लिए इसी desat1 हाइड्रोकार्बन यौगिकों को दोनों पुरुषों और 9 महिलाओं के लिए आम के उत्पादन के लिए आवश्यक है, और desatF महिला विशिष्ट हाइड्रोकार्बन 10,11 यौगिकों के उत्पादन में शामिल है desatF के लिए विशेष रूप से व्यक्त होना दिखाया गया है. स्वस्थानी संकरण 12 में महिला oenocytes में. ध्यान दें कि औसत पर कुल शाही सेना के 15 20ng एक व्यक्ति मक्खी से dissected oenocytes से प्राप्त की है. शाही सेना RNeasy सूक्ष्म किट (Qiagen) का उपयोग कर पृथक किया गया, सीडीएनए qScript cDND संश्लेषण किट (क्वांटा बायोसाइंसेज) का उपयोग कर उत्पादन किया गया था
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Discussion
इस वीडियो लेख में हम वयस्क से oenocytes की तैयारी के लिए एक विस्तृत विच्छेदन प्रोटोकॉल वर्तमान डी. आणविक विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त तरीके से मेलानोगास्टर . 2 कहीं एक संक्षिप्त विच्छेदन विधि का पाठ आधारित खाते में वर्णित किया गया है, और oenocyte तैयारी जिसके परिणामस्वरूप दोनों शाही सेना और प्रोटीन 2 की निकासी के लिए उपयुक्त होना प्रदर्शित किया गया है . इस तैयारी का उपयोग करना भी संभव हो explanted oenocytes के संवर्धन के लिए तरीकों को विकसित कर सकते हैं. एक oenocyte explant संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल इन कोशिकाओं के स्वायत्त चयापचय क्षमता का निर्धारण करने के लिए synthesize और cuticular हाइड्रोकार्बन की रासायनिक घटक छिपाना करने के उद्देश्य से जांच की सहायता करेंगे. एक हाल ही में विकसित oenocyte - Gal4 4 लाइन, जो oenocytes लक्षित आनुवंशिक हेरफेर परमिट के साथ संयोजन में इन तकनीकों वयस्क फल मक्खी में oenocyte समारोह का विस्तृत आणविक आनुवांशिक विश्लेषण के लिए अनुमति देगा .
Oenocyte कोशिकाओं दोनों लार्वा और वयस्क मक्खी में पाए जाते हैं. जबकि इन कोशिकाओं को कई आकारिकी और ultrastructural समानता का हिस्सा है, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि वयस्क मक्खी के oenocytes developmentally उन है कि भ्रूण विकास के दौरान अंतर और लार्वा 5 चरणों के दौरान मौजूद से अलग कर रहे हैं. वयस्क oenocytes 6 histoblasts से प्राप्त किया जा pupation दौरान डी Novo बनाने और वयस्क 7 जीवन के पहले सप्ताह के दौरान संख्या में वृद्धि जारी रखने सूचित किया गया है. जबकि वयस्क फल मक्खी के oenocytes cuticular 4 हाइड्रोकार्बन के उत्पादन के लिए आवश्यक हैं, यह निर्धारित किया अगर लार्वा oenocytes एक समान कार्य का समर्थन रहता है. इसी तरह, लार्वा oenocytes hepatocyte लिपिड चयापचय 8 करने के लिए संबंध के साथ जैसे कार्यों को बनाए रखने, एक समान भूमिका अभी तक नहीं वयस्क के oenocytes के लिए दिखाया गया है. तैयारी यहाँ प्रदर्शन डिग्री के लिए जो लार्वा और वयस्क oenocytes कार्यात्मक समान हैं निर्धारित करने के उद्देश्य से कर रहे हैं कि जांच में सहायता करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उसकी सहायता के लिए इस वीडियो लेख के फिल्मांकन में Amsale belay धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम CIHR, NSERC और JDL के लिए सीआरसी अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
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