Summary
Данио рерио стала мощным
Abstract
Учитывая их небольшой размер эмбриона, быстрое развитие, прозрачность, плодовитость, а также многочисленные молекулярные, морфологические и физиологические сходства с млекопитающими, данио стала мощным
Protocol
1) данио рерио сбора яиц
- Во второй половине дня до дня химических экран, созданный 10 до 20 танков данио разведения. Заполните каждый бак с водой из аквакультуры системы. Использование рыболовные сети, передачу один взрослый мужчина и одного-двух взрослых женщин, чтобы внутренний контейнер в каждом разведении танк. Отдельные мужские и женские рыб друг от друга перегородкой. Этикетка клетки и положил крышку над ними.
- С утра на экране, удалите делителей из разведения танков и позволяют данио к спариванию. В течение следующего 1 часа, позволяют оплодотворенной икры падать через решетку в нижней части каждой внутренней емкости.
- Через 1 час возвращения взрослых данио обратно в постоянное резервуаров, удалите внутренний контейнер и собирать яйца, напрягая воды в каждом разведении бака через фильтр пластиковый чая.
- Обратить фильтр по чашке Петри и промыть фильтр аккуратно, чтобы смыть яйца в чашке Петри с помощью вымыть бутылку с E3 среды.
- Все неоплодотворенные яйца, которые появляются непрозрачные, должны быть удалены с помощью одноразовой пипетки пластика. Каждый спаривания крест должно дать около 200 эмбрионов.
2) Arraying Эмбрионы в 96-луночных планшетах
- Передача около 5 эмбрионов в E3 среды в каждую лунку 96-луночного планшета с помощью стеклянной пипетки Пастера.
- Как только эмбрионы выстраиваются на 96-луночного планшета, удалите как можно больше E3 среды как возможного из скважин с помощью 12-канальной (30 - 300 мкл) пипетки, заботясь, чтобы не проколоть эмбриона. Использование 12-канальная пипетка, доставить 250 мкл E3 среде, содержащей канамицин 0.5μg/ml в каждую лунку как можно быстрее, чтобы не позволить эмбрионов высохнуть.
- Положите 96-луночных планшетах в 28,5 ° C инкубаторе, пока не достигнете желаемого стадии, когда соединения, которые будут добавлены.
3) Передача малых Библиотека Молекула
Хотя соединение передачи может быть автоматизирован с роботом каналов передачи данных, мы расскажем ручного способа переноса.
- Малые библиотеки молекулы, как правило, поставляются в 96-луночного формата, с каждого соединения хранится в ДМСО в качестве 10 фондовом мМ. Около 60 минут до эмбрионы достигают стадии, когда соединения должны быть добавлены, оттепель необходимое количество 96-луночного содержащих аликвоты малых молекул (источник пластины). Обратите внимание на серийный или другой идентификационный номер источника пластин. Чтобы свести к минимуму образование конденсата на пластинах, таяние может произойти в высыхания камеру, содержащую Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Ксения, штат Огайо).
- Кратко спином вниз пластин в настольные центрифуги оснащен мульти-луночного планшета адаптера.
- Удалить алюминиевой ленты уплотнения из исходных пластины. Использование 12-канальная пипетка, развести соединений в исходном пластину с концентрацией 0,5 мм (например, если, начиная с 250 аликвот нл акций 10мм, добавить 4,75 мкл ДМСО в каждую лунку).
- Когда эмбрионов в 96-луночного планшета (получателя пластины) достигают желаемого этапе служит 12-канальный (2-20 мкл) пипетки для передачи 2.5μL соединений (0,5 мм) от источника пластин в получатель чашки, содержащие эмбрионов.
- Запись идентификационный номер источника плит на пластины получателя эмбриона. Обложка получателя пластин теперь содержащих эмбрионы и соединений с крышками, осторожно перемешать, осторожно пластины вихрей, и поместите их в 28,5 ° C инкубатора.
- Обложка каждого источника пластины, содержащей неиспользованные малых молекул (0,5 мм) с алюминиевой ленты герметизации и место в -80 ° C морозильнике в течение длительного хранения.
4) Скрининг по воздействию малых молекул при визуальном осмотре фенотипов
- Перед выполнением экран, сформулировать конкретные критерии для того, что будет представлять собой "хит".
- В нужное время в развитии, удалите 96-луночных содержащего соединения обработанных эмбрионов из инкубатора и исследовать каждую лунку под стереомикроскопа. Для лучшей визуализации тонкие изменения, такие как изменения в кровеносной узор, фазового контраста инвертированный микроскоп может быть использован. Флуоресцентная микроскопия может быть использована для изучения возмущений выражения GFP или DsRed белков под тканеспецифические промоутера.
- Быстрое сканирование 96-луночных планшетах для любой ямы, в которой по крайней мере 3 из 5 эмбрионов выставку предписано "хит" фенотип. Запись личность пластину и также расположение каждого потенциального хита.
- Подтвердить потенциальных пострадавших от повторного тестирования эффектов соединения на нескольких доз (1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкм и 50 мкм). Для каждой дозы, 10 эмбрионов проходят испытания в 0,5 мл E3 средств массовой информации в 48-луночный планшет формата. Сроки соединения дополнение для повторного тестирования должна быть идентична оригинальной скрининга. Хит подтверждается, когда вызвали фенотип воспроизводится на повторное тестирование compounг
- Определить хит соединения из базы данных малых молекул в химической библиотеки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При планировании данио основе химических экран, особое внимание должно быть обращено на надежность фенотипа на рассмотрении и фона скорость такой фенотип. Это особенно важно для экранов для химической супрессоров индуцированного фенотипа. Например, для фенотип вызванных теплового шока индукция трансгенов, условии, что вызывает фенотип воспроизводимо должны быть четко наметил перед началом экран, чтобы избежать неприемлемо высокий уровень ложных срабатываний. При тщательном планировании, данио химических экранов, которые требуют скромных капитальных вложений, может привести к открытию новых модулятор клеточной сигнализации и физиологии, а также привести к обратным соединением модели заболеваний человека. Наконец, по аналогии с классическим вперед генетические экраны, данио основе экранов химическое вещество может быть ценным для химической генетических рассечение фундаментальных биологических процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype. | |||
| Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats). | |||
| Petri dishes (10 cm). | |||
| Plastic tea strainer. | |||
| Wash bottle containg embryo water. | |||
| Disposable polyethylene transfer pipettes. | |||
| Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA). | |||
| Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific). | |||
| Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). | |||
| E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil. | |||
| 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf). | |||
| 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf). | |||
| Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific). | |||
| Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use. | |||
| Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY). | |||
| DMSO (Sigma, St. Louis, MO). | |||
| Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific). | |||
| Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). |
References
- Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
- Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
- Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
- Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).
