Summary
كما برز الزرد قوية
Abstract
نظرا لحجمها الصغير الجنين ، التطور السريع ، والشفافية ، والخصوبة ، والعديد من أوجه الشبه الجزيئي ، المورفولوجية والفسيولوجية للثدييات ، برز الزرد وقوية
Protocol
1) جمع بيض اسماك الزرد
- بعد ظهر يوم قبل يوم من الشاشة الكيميائية ، وإعداد 10-20 الدبابات تربية الزرد. ملء كل صهريج ماء من نظام تربية الأحياء المائية. باستخدام صافي الأسماك ، نقل أحد الذكور والإناث البالغين الكبار 1-2 إلى حاوية الداخلية في كل خزان التربية. فصل الأسماك الذكور والإناث من بعضهم البعض مع المفرق. تسمية الأقفاص ووضع غطاء عليها.
- في صباح يوم من الشاشة ، إزالة فواصل من الدبابات والسماح للتربية الزرد لزميله. على مدى ساعة 1 التالي ، والسماح لسقوط البويضات المخصبة من خلال الشبكة في الجزء السفلي من كل حاوية الداخلية.
- بعد 1 ساعة ، والعودة مرة أخرى إلى الزرد الكبار صهاريج التخزين الدائمة ، وإزالة الحاوية الداخلية وجمع البيض بنسبة توتير المياه في كل خزان تربية من خلال مصفاة الشاي البلاستيكية.
- عكس المصفاة على طبق بتري وشطف مصفاة برفق لطرد البيض في صحن بيتري باستخدام زجاجة تحتوي على غسل المتوسطة E3.
- يجب إزالة كل بويضة غير مخصبة ، والتي تظهر مبهمة ، وذلك باستخدام الماصة البلاستيكية. ينبغي لكل عبر التزاوج العائد حوالي 200 الأجنة.
2) Arraying الأجنة في 96 - جيدا لوحات
- نقل الأجنة حوالي 5 في المتوسط في كل بئر E3 من لوحة 96 - جيدا باستخدام ماصة باستير الزجاج.
- بمجرد المحتشدة الأجنة على طبق 96 - جيدا ، وإزالة أكبر قدر من المتوسط E3 النحو المبين ممكن من الآبار باستخدام 12 قناة (3-30 ميكرولتر) ماصة ، مع الحرص على عدم ثقب الجنين. باستخدام ماصة 12 قناة ، وتقديم 250 ميكرولتر المتوسطة E3 تحتوي على الكاناميسين 0.5μg/ml إلى كل بئر في أسرع وقت ممكن حتى لا تسمح للأجنة لتجف.
- وضع لوحات 96 - جيدا داخل الحاضنة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة المرجوة عندما تضاف هذه المركبات.
3) نقل المكتبة جزيء صغير
بينما يمكن نقل مجمع الآلي مع وسائل نقل الروبوتية ، سنقوم بشرح طريقة نقل يدوي.
- عادة ما يتم توفيره من المكتبات جزيء صغير في شكل 96 - جيدا ، مع كل مجمع المخزنة في DMSO باعتباره المخزون 10 مم. حوالي 60 دقيقة قبل ان يصل الى مرحلة الأجنة عندما المركبات هي التي يمكن ان تضاف ، أذاب العدد المرغوب فيه من جانب 96 لوحات تحتوي على aliquots من جزيئات صغيرة (لوحة المصدر). يحيط علما رقم هوية المسلسل أو غيرها من لوحات المصدر. لتقليل التكثيف على لوحات ، ويمكن أن يحدث الذوبان في غرفة تحتوي على تجفيف Drierite (WA هاموند DRIERITE CO ، زينيا ، OH).
- تدور باستمرار لفترة وجيزة في جهاز للطرد المركزي لوحات الطاولة مجهزة محول لوحة متعددة أيضا.
- إزالة الشريط من لوحة الالومنيوم ختم المصدر. باستخدام ماصة 12 قناة ، ويخفف من المركبات الموجودة في لوحة مصدر للتركيز 0.5 ملم (على سبيل المثال ، إذا بدءا aliquots NL 250 من الاسهم 10MM ، إضافة 4.75 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر).
- عند الأجنة في لوحة 96 - جيدا (لوحة المتلقي) يصل الى مرحلة المطلوبة ، استخدم لمدة 12 قناة (2-20 ميكرولتر) ماصة لنقل المركبات 2.5μL (0.5mM) من لوحات لوحات المصدر إلى المتلقي تحتوي على الأجنة.
- تسجيل عدد من لوحات تحديد المصدر على لوحات الجنين المتلقية. تغطي لوحات تحتوي على المتلقي الآن الأجنة والمركبات مع الأغطية ، ومزيج بلطف بواسطة لوحات يحوم بلطف ، ووضعها في الحاضنة 28.5 درجة مئوية.
- تغطي كل لوحة تحتوي على جزيئات صغيرة مصدر غير المستخدمة (0.5 ملم) مع الالومنيوم ختم الشريط ومكان في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين.
4) الكشف عن تأثيرات الجزيئات الصغيرة عن طريق التفتيش البصري من الظواهر
- قبل تنفيذ الشاشة ، ووضع معيار محدد لما من شأنه أن يشكل "ضرب".
- في بعض الأحيان في عملية التنمية المنشودة ، وإزالة لوحات تحتوي على 96 - جيدا مجمع المعالجة أجنة من الحاضنة ودراسة كل جانب تحت stereomicroscope. لأفضل تصور التغييرات الطفيفة ، مثل التغيرات في نمط الدورة الدموية ، ويمكن استخدام المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. يمكن أن تستخدم لفحص المجهري الفلورسنت اضطراب التعبير GFP أو البروتينات DsRed المروج تحت الأنسجة محددة.
- مسح سريع لوحات 96 - جيدا لأي جيدا في ما لا يقل عن 3 من أصل 5 أجنة يحمل المقررة "ضرب" النمط الظاهري. سجل هوية لوحة ومكان جيد للضرب كل المحتملة.
- تأكيد ضربة محتملة من إعادة اختبار آثار المجمع في عدة جرعات (1 أم أم 5 ، 10 ميكرومتر وميكرومتر 50). لكل جرعة ، يتم اختبار الأجنة في 10 مل من 0.5 E3 وسائل الاعلام في شكل صفيحة ال 48 أيضا. وينبغي أن توقيت بالإضافة لمجمع إعادة الاختبار تكون مماثلة لفحص الأصلي. وأكد هو ضرب عندما يرد على النمط الظاهري أثارت إعادة الاختبار للcompounد
- التعرف على مجمع ضرب من قاعدة البيانات من جزيئات صغيرة في المكتبة الكيميائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند التخطيط لشاشة الكيميائية الزرد مقرها ، يجب إيلاء اهتمام خاص لمتانة النمط الظاهري قيد النظر ، ومعدل خلفية النمط الظاهري من هذا القبيل. وهذا أمر مهم لا سيما بالنسبة للشاشات المكثفات الكيميائية من النمط الظاهري المستحث. على سبيل المثال ، عن النمط الظاهري التي تسببها حرارة الصدمة تحريض من التحوير ، شريطة أن الحث على النمط الظاهري يجب أن يتم تعيينها على وجه التحديد بتكاثر بها قبل الشروع في الشاشة لتجنب معدلات مرتفعة بشكل غير مقبول إيجابية كاذبة. مع التخطيط الدقيق ، يمكن شاشات الكيميائية الزرد ، والتي تتطلب استثمار رؤوس الأموال المتواضعة ، قد يؤدي إلى اكتشاف المغير الرواية من إشارات الخلية وعلم وظائف الأعضاء ، وكذلك المركب يؤدي إلى عكس نماذج من الأمراض التي تصيب الإنسان. أخيرا ، قياسا إلى الأمام الكلاسيكية شاشات الوراثية ، يمكن شاشات الكيميائية الزرد المستندة تكون ذات قيمة للتشريح الكيميائية الجيني للعملية بيولوجية أساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
| Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype. | |||
| Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats). | |||
| Petri dishes (10 cm). | |||
| Plastic tea strainer. | |||
| Wash bottle containg embryo water. | |||
| Disposable polyethylene transfer pipettes. | |||
| Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA). | |||
| Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific). | |||
| Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ). | |||
| E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil. | |||
| 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf). | |||
| 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf). | |||
| Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific). | |||
| Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use. | |||
| Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY). | |||
| DMSO (Sigma, St. Louis, MO). | |||
| Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific). | |||
| Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL). |
References
- Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
- Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
- Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
- Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).
