Large Scale zebravis-Based In vivo Kleine Molecule Screen

Summary

Zebravis heeft ontpopt als een krachtig

Abstract

Gezien hun geringe omvang embryo, snelle ontwikkeling, transparantie, vruchtbaarheid, en tal van moleculaire, morfologische en fysiologische overeenkomsten met zoogdieren, heeft zebravis ontpopt als een krachtig

Protocol

1) zebravis Ei Collectie

1. Op de middag voorafgaand aan de dag van de chemische scherm, opgezet 10 tot 20 zebravis kweekbakken. Vul elke tank met water uit de aquacultuur systeem. Met behulp van een visnet, overdracht een volwassen man en een tot twee volwassen vrouwtjes tot innerlijke container in elk kweekbak. Scheiden de mannelijke en vrouwelijke vis uit elkaar met een divider. Het etiket van de kooien en doe een deksel over hen.
2. Op de ochtend van het scherm, verwijder de verdelers van de kweekbakken en laat zebravis om te paren. In de loop van volgende een uur, laat bevruchte eieren door het rooster vallen op de bodem van elke binnenverpakking container.
3. Na 1 uur, terug volwassen zebravissen naar permanente opslag tanks, verwijder dan de binnenste container en het verzamelen van de eieren door zeven het water van elk kweekbak door middel van een plastic theezeefje.
4. Keer de zeef op een petrischaaltje en voorzichtig spoel de zeef om de eieren te spoelen in de petrischaal met behulp van een wasfles met de E3 medium.
5. Alle onbevruchte eieren, die verschijnen ondoorzichtige, moeten worden verwijderd met een wegwerp plastic pipet. Elke paring kruis moet opleveren van ongeveer 200 embryo's.

2) Arraying embryo's in 96-well platen

1. Breng ongeveer 5 embryo's in E3 medium in elke well van een 96-wells plaat met behulp van een glas Pasteur pipet.
2. Zodra embryo's worden geschaard op de 96-well plaat, verwijder zoveel mogelijk van de E3 medium mogelijk uit de bronnen met behulp van een 12-kanaals (30 - 300 ul) pipet, zorg ervoor dat u doorboren het embryo. Met behulp van de 12-kanaals pipet, leveren 250 ul van E3 medium dat 0.5μg/ml kanamycine aan elk putje zo snel mogelijk zo niet toe te staan ​​embryo's op te drogen.
3. Leg de 96-well platen in de 28,5 ° C incubator totdat ze de gewenste fase waarin de verbindingen worden toegevoegd.

3) Overdracht van kleine molecule Bibliotheek

Terwijl de compound overdracht kan worden geautomatiseerd met robots overdracht methoden, beschrijven we de handleiding overdrachtmethode.

1. Klein molecuul-bibliotheken worden meestal geleverd in een 96-wells formaat, met elke verbinding opgeslagen in DMSO als een 10 mM voorraad. Ongeveer 60 minuten voor de embryo's het podium te bereiken wanneer de verbindingen moeten worden toegevoegd, dooi een gewenst aantal 96-well platen bevattende fracties van kleine moleculen (bron plaat). Kennis te nemen van de seriële of ander identificatienummer van de bron platen. Te minimaliseren condensatie op de borden, kan ontdooien optreden in een kamer met verdroging Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. Kort spin down de platen in een tafelblad centrifuge uitgerust met een multi-well plaat adapter.
3. Verwijder de aluminium plakband van de bron plaat. Met behulp van een 12-kanaals pipet, verdunnen de verbindingen in de bron plaat om de concentratie van 0.5 mM (bijvoorbeeld wanneer beginnen met 250 nL fracties van 10mm voorraad, voeg 4,75 ul van DMSO aan elk putje).
4. Als de embryo's in de 96-well plaat (ontvanger plaat) het gewenste stadium te bereiken, gebruik dan een 12-kanaals (2-20 pi) pipet op 2.5μL van verbindingen (0,5 mm) over te dragen van de bron platen in de ontvanger platen met de embryo's.
5. Noteer het identificatienummer van de bron platen op de ontvanger embryo platen. Dek de ontvanger platen nu met de embryo's en verbindingen met deksels, meng de platen onder voorzichtig schudden, en leg ze in een 28,5 ° C incubator.
6. Bedek elke bron bord met ongebruikt kleine moleculen (0,5 mm) met een aluminium afdichting tape en plaats in een -80 ° C vriezer voor opslag op lange termijn.

4) Screening voor de effecten van kleine moleculen door visuele inspectie van fenotypes

1. Voorafgaand aan het uitvoeren van het scherm, formuleren een specifiek criterium voor wat een "hit" vormen.
2. Op de gewenste tijden in ontwikkeling, verwijder de 96-well platen bevattende verbinding behandelde embryo's daarvan uit incubator en onderzoek elk goed onder een stereomicroscoop. Voor een betere visualisatie van subtiele veranderingen, zoals veranderingen in de bloedsomloop patroon, kan een fase-contrast omgekeerde microscoop worden gebruikt. Fluorescentie microscopie kan worden gebruikt om verstoring van de expressie van GFP of DsRed eiwitten te onderzoeken onder een weefsel-specifieke promotor.
3. Snel scannen van de 96-wells platen voor elke goed waarbij ten minste 3 van de 5 embryo's vertonen het voorgeschreven "hit" fenotype. Noteer de identiteit van de plaat en de goed plaats van elke potentiële hit.
4. Herbevestigen een potentieel getroffen door opnieuw testen van de effecten van de verbinding bij verschillende doses (1 uM, 5 uM, 10 uM en 50 uM). Voor elke dosis, worden 10 embryo's getest in 0,5 ml van de E3 media in een 48-wells plaat-formaat. De timing van samengestelde aanvulling voor hertesten moet identiek zijn aan die van de oorspronkelijke screening. Een hit wordt bevestigd wanneer de opgewekt fenotype wordt gereproduceerd op opnieuw testen van de compound
5. Identificeer de hit verbinding uit de database van kleine moleculen in de chemische bibliotheek.

Discussion

Bij het plannen van een zebravis-gebaseerde chemische scherm, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de robuustheid van het fenotype in kwestie en de achtergrond van een dergelijke snelheid fenotype. Dit is vooral van belang voor schermen voor chemische onderdrukkers van een geïnduceerde fenotype. Bijvoorbeeld, voor een fenotype veroorzaakt door hitte-shock inductie van een transgen, de voorwaarde dat het fenotype induceert reproduceerbaar moet precies in kaart worden gebracht voordat wordt begonnen met het scherm tot een onaanvaardbaar hoog percentage valse positieven te vermijden. Met een zorgvuldige planning, kan zebravis chemische-schermen, die een bescheiden investeringen vereisen, leiden tot de ontdekking van nieuwe modulator van cel signalering en fysiologie, als lead compound tot modellen van menselijke ziekten te keren. Ten slotte, naar analogie van de klassieke naar voren genetische screens, kan zebravis-gebaseerde chemische-schermen waardevol zijn voor de chemische genetische dissectie van fundamenteel biologisch proces.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number
Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
Petri dishes (10 cm).
Plastic tea strainer.
Wash bottle containg embryo water.
Disposable polyethylene transfer pipettes.
Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).