Summary
Этот протокол описывает надежный метод обезболивания и обработки изображений интактных
Abstract
Последние достижения в оптических изображений, генетически закодированы флуорофоров и генетических инструментов, позволяющих эффективное создание желаемых трансгенных линий животных позволили биологических процессов, которые будут изучены в контексте жизни, а в некоторых случаях даже себя, организм. В этом протоколе мы опишем, как обезболить нетронутыми личинки дрозофилы с использованием летучих анестетиков десфлуран, следить за развитием и пластичность синаптических населения на субклеточном разрешение 1-3. Хотя другие полезные методы, чтобы обезболить личинки дрозофилы были ранее описаны 4,5,6,7,8, протокол, представленные здесь, демонстрирует значительное улучшение за счет следующих комбинированных ключевые особенности: (1) очень высокая степень обезболивания, и даже сердце билось арестован позволяет пространственным разрешением до 150 нм, 1, (2) высокая выживаемость> 90% в обезболивания цикла, что позволяет запись более пяти временных точках в течение периода от нескольких часов до нескольких дней и 2 ( 3) высокая чувствительность позволяет нам в 2 случаях для изучения динамики белков, высказанные на физиологическом уровне. В деталях, мы смогли визуализировать постсинаптических субъединицы рецептора глутамата GluR-IIA выражается через эндогенные промоутер 1 в стабильной трансгенных линий и линии экзона ловушку FasII-GFP 1. (4) В отличие от других методов 4,7 личинки могут быть отображены не только жив, но и без изменений (т.е. не расчлененный), что позволяет наблюдения происходят в течение нескольких дней 1. Сопровождающих детали видео функции отдельных частей в естественных изображений камера 2,3, правильной установке личинки, обезболивания процедуры, как заново определить конкретные должности в личинки и безопасного удаления личинок из изображений камеры.
Protocol
) Ассамблея изображения камеры
- Выберите личинки выбрали этапе (например, ранний 3-го возраста личинки оставляя интервале наблюдения около 24 часов при 25 ° С до блуждающих этап).
- Промыть водой личинки, чтобы очистить его от питательной среды и промокните насухо.
- Пальто центре нижней элемент камеры, регион к лицу личинки, с тонкой пленкой галоидоуглеводородов нефти.
- Положите личинки с вентральной стороне, обращенной объектива микроскопа в камере (позволяет нервно-мышечном соединении (NMJ) 26 и 27 для включения в образ) (рис. 1 АЕ).
- Место пластиковую прокладку на масляный слой, с воздуха слоты сетке лицом вверх (рис. 1). Пожалуйста, убедитесь в этом шаге: высота спейсера примерно половину личиночной диаметре, ширина щели должна быть примерно в два раза диаметр личинки.
- Место изображения камеры на микроскоп
Б) обезболивания личинки
- Подключите два входа в камеру с соответствующим обезболиванием устройство / испарителем.
Проверьте авансовые:
Эффективная концентрация десфлуран в комнате воздуха не должна превышать величину, указанную на правила техники безопасности! Лишь очень небольшая общего объема десфлуран необходимо для обезболивания личинок. Применение 15% (объем / объем) десфлуран 1 оказалась хорошей отправной точкой для определения идеальной концентрации, которые будут использоваться в эксперименте. По соображениям безопасности мы рекомендуем испаритель никогда не должны содержать больше, чем нужно десфлуран в течение 2-4 часов в визуализации естественных условиях. - Погрузите другом конце трубки прикреплен к камере выход в стакан с водой затем открыть клапаны регулирования потока анестетика в камере в течение примерно пяти секунд.
Пожалуйста, проверьте на этом этапе:
Есть ли пузырьки воздуха поднимаются в воде? Если нет камеры вытекающих. - Закройте клапаны в течение примерно трех секунд.
- Монитор остаточного личиночной движений в микроскоп. Проверьте оба сердца и мышечных движений. При необходимости открытия и закрытия клапанов, как описано в шаге 8 и 9, пока обезболивания личинки полно, то закрыть все клапаны и начать съемки.
Пожалуйста, проверьте на этом этапе:
Остаточная движения мышц или сердцебиение указывает, что личинки не правильно наркозом. Полное обезболивание является жизненно важным для изображений с высоким разрешением. Личинка правило, не должен быть под наркозом в течение более 15-20 минут в данный момент времени.
С) изображений
- Определите правильное положение и имидж структуры процентных (рис. 2-4).
D) Восстановление после анестезии
- После завершения визуализации позволяют воздуха в камере.
Пожалуйста, проверьте на этом этапе:
Проверьте биение сердца и мышечных сокращений личинки в проходящем свете галогенных. Как мышцы начинают договаривающиеся это безопасно для удаления личинок из камеры изображений. - Отсоедините камеру от обезболивания устройство и удалить его из микроскопа. Разберите камеру тщательно и месте личинки в пюре среду культивирования летать.
- Магазин блюдо в инкубаторе при соответствующей температуре.
Е) Временные ряды
- Повторите шаги 2-14 до достаточного моменты времени были получены.
Альтернативный протокол:
Если личинка для включения в образ больше, чем один раз в течение 30-минутного интервала может быть практичным, чтобы оставить его в камере изображение до следующего момента времени обезболивания. Повторите шаги 7-14 до достаточного моменты времени были получены.
Пожалуйста, проверьте на этом этапе:
Личинка не иметь в камере изображения в течение более двух часов за один раз, и это не должны быть под наркозом в течение более 15-20 минут за один раз.
Рисунок 1 Ассамблеи изображения камеры. () Место личинки и пластиковую прокладку на масляный слой. (Б) Место 22 х 22 мм покровным стеклом на втулку и вставить кольцо оргстекло руководство в камеру, рядом (С) фиксируют положение личинки с металлическим кольцом, и (D), близкий камеры. (E) Теперь камера готова для установки на микроскоп.
Рисунок 2 Body-стена мышц у личинок дрозофилы. Мышцы и NMJs были визуализированы выражение CD8-GFP-Ш гибридный белок 8. Мышцы показано как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинку. В (AC) самая поверхностная мышца, 27, Показано, в (KL) наиболее интерьера мышцы, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала Бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 2 мкм.
Рисунок 3 Идентичность тела стене мышц у личинок дрозофилы. Личность мышцы L3 дрозофилы личинки, сегмент A3, это показано на рисунке. Мышцы и NMJs были визуализированы выражение CD8-GFP-Ш гибридный белок 8. Мышцы отображаются как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинок. В переменного тока самое поверхностное мышц, 27, показано, в КЛ самых внутренних мышц, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 2 мкм.
Рисунок 4 Идентичность нервно-мышечных соединениях личинки дрозофилы. (AD) NMJs были визуализированы выражение DGluRIIA-mRFP гибридный белок 1. NMJs показаны как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинку. В (АВ) самый поверхностный NMJ, 27, Показано, в CD наиболее интерьера NMJs, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 5 мкм. (Е) и (F) идентичность поверхностных (E) и более интерьера (F) NMJs дается для справки.
Discussion
Представленный метод был первоначально разработан для изучения глутаматергической синапсы на стенки тела мышцы личинок дрозофилы. Дрозофилы нервно-мышечном соединении (NMJ) характеризуется стереотипными цито-архитектура мышц и нейронов и, таким образом, идеально подходит для обработки изображений естественных условиях. Тем не менее, описанные обезболивания протокол не ограничивается изображениями NMJ; прозрачность личинок дрозофилы облегчает адаптацию описанного протокола с целью изучения развития органов, миграция клеток, перевозки грузов и аксонального субклеточном реорганизации внутри клеток.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Андреаса Schönle, Макса-Планка-Института биофизической химии, Германии и Дэвид Дж. Сандстром, Национальный институт психического здоровья, Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Мэриленд, США за технической консультацией. Мы благодарим Фрэнка Kötting, Европейский Институт неврологии, Геттинген для построения изображения камеры и обезболивания устройства. Эта работа была поддержана грантами от болезни Альцгеймера Forschung инициативы по TMRYZ была поддержана общение Китай совета по стипендиям, SBH на общение Высшая школа для клеточной и молекулярной неврологии, Университет Тюбингена.
Materials
Reagents:
Equipment:
|
References
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , Georg-August-University Göttingen. (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L.
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &, Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
