Summary
Detta protokoll beskriver hur att kvantifiera synaps antal både i dissocierade neuronala kultur och i hjärnan sektioner med hjälp av immuncytokemi. Använda fack-specifika antikroppar, etikett vi presynaptiska terminaler samt platser av postsynaptiska specialisering. Vi definierar synapser som punkter av colocalization mellan de signaler som genereras av dessa markörer.
Abstract
En av de viktigaste målen inom neurovetenskap är att förstå de molekylära signaler som instruerar tidiga stadier av synaps bildas. Som sådant har det blivit nödvändigt att utveckla objektiva metoder för att kvantifiera förändringar i synaptisk anslutning. Från prov fixering, detta protokoll beskriver hur att kvantifiera synaps antal både i dissocierade neuronala kultur och i hjärnan sektioner med hjälp av immuncytokemi. Använda fack-specifika antikroppar, etikett vi presynaptiska terminaler samt platser av postsynaptiska specialisering. Vi definierar synapser som punkter av colocalization mellan de signaler som genereras av dessa markörer. Antalet sådana colocalizations är kvantifieras med hjälp av en plug in Puncta Analyzer (skriven av Bary Wark, på begäran, c.eroglu @ cellbio.duke.edu) under ImageJ analysen mjukvaruplattform. Synapsen analys som beskrivs i detta protokoll kan tillämpas på alla nervvävnad eller kultur förberedelse för vilka du har selektiv pre-och postsynaptiska markörer. Denna synaps-analysen är ett värdefullt verktyg som kan vara allmänt används i studiet av synaptiska utveckling.
Protocol
Lösningar förbereda:
- Antibody buffert:
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-base (Fisher, Cat nr:. BP152-5, 50 mm) - 1,21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat nr:. A2153, 1%) - 2,0 g
- 100 mm L-lysin (Sigma, Cat nr:. L-1137, 100 mm) - 3,65 g
- Justera pH till 7,4
- 0,04% Azid
- Justera volymen till 200 ml med destillerat H 2 O.
- Filtrera genom 0.22μm filter (Millipore, Cat nr:. SCGPU02RE).
- PFA Diluant:
- 168 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (dibasiskt)
- 72 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 (enbasiskt)
- 660 ml destillerat H 2 O
- 4% PFA fixativ för odlade neuron (lösning # 2):
- 10 ml 16% PFA-lösning (elektronmikroskopi vetenskaper, Cat nr:. 15.711)
- 30 ml 4% PFA diluant (lösning # 2)
- 4% PFA i PBS:
- 4 g PFA (Electron Microscropy vetenskaper, Cat nr:. 19.210)
- 100 ml PBS (Invitrogen, Cat nr:. 20.012-027)
- Värm till 40 ° C, rör om natten.
- Filtrera genom ett 0.22μm filter (Millipore, Cat nr:. SCGPU02RE)
- Blockerande buffert (Total volym (för 24-brunnar) = (# täckglas +1) x 200μl)
- 50% Antibody buffert (lösning # 1)
- 50% Normal get serum (Gibco, Cat nr:. 16.210)
- 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics GmbH, Cat nr:. 9002-93-1)
- 30% sackaros i PBS
- 30 g sackaros (MP Biomedicals, Inc., Cat nr:. 821.713)
- 70 ml PBS (Invitrogen, Cat nr:. 20.012-027)
- Blanda med en stirbar tills sackaros är i lösning.
- Ta upp volymen till 100 ml med PBS
- Filtrera genom 0,22 ìm filter (Millipore, Cat nr:. SCGPU02RE)
Beredning av Neuronal kulturer:
Protokollet som beskrivs här är tillämplig på alla primära neuronala kulturer som odlas på 12 täckglas mm glas (Karl Hecht, nr O, Cat nr:. 99.010) i 24-brunnars plattor (Falcon, 35-3047). Till exempel, i vårt laboratorium har vi kultur råtta retinal ganglion celler (RGC: er) som renats från råtta näthinnan skördas från P5-7 djur 1,2. Celler odlas på glas täckglas täckta med poly-D-lysin (Sigma, Cat nr:. P6407) (.: 3400-010-01 Cultrex, Cat nej) och mus laminin. Vi använder denna kultur beredning i ett par olika sätt för våra synaps analysen. En manipulation som vi utför innebär odling RGC: er antingen i närvaro eller frånvaro av astrocyternas-utsöndras synaptogenic faktorer. Alternativt använder vi också dessa olika behandling förhållanden i experiment där RGC: er har transfekterade att överuttrycker ett protein av intresse. I det senare fallet samarbetar vi transfektera cellerna med en cell etikett (t.ex. GFP eller tdTomato). Dessa olika experimentella metoder att påverka hur man utför vissa steg i en synaps-analys som vi klargöra nedan.
1. Fastställande dissocierade Renat RGC: er
- Ta bort odlingsmedia från RGC innehåller brunnar och tillsätt 500 l (för en 24 brunnar) 4% paraformaldehyd (PFA) uppvärmd till 37 ° C i varje brunn. Låt cellerna att fixa i 7 minuter vid rumstemperatur.
- Efter fixering skölj celler 3 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (Invitrogen, Cat nr:. 20.012-027). VIKTIGT: Celler ska aldrig lämnas utan vätska i brunnar, en gång en buffert tas bort från ett väl det bör snarast ersättas med nästa buffert. Vid denna punkt, celler är redo för immunfärgning.
2. Blockering Ospecifika bindningsställen på RGC: er
- Förbered blockerande buffert som innehåller 50% normal get serum (NGS, Gibco, Cat nr:. 16.210) och 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics GmbH, Cat nr:. 9002-93-1). Efter att PBS från varje brunn, tillsätt 200 ìl av blockerande buffert i varje brunn och block för 30 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort blockerande buffert och skölj tre gånger med PBS.
3. Tillämpa primär antikropp lösning
- VIKTIGT: Var noga med att välja primära antikroppar för din pre-och postsynaptiska markörer som erhålls från olika arter.
- Förbered en primär antikropp spädning i 90% antikroppar buffert, 10% NGS lösning som innehåller före-och postsynaptiska antikroppar par av ditt val. Till exempel kanin anti-synapsynd (presynaptisk markör) (1:750, cytosoliskt domän, Synaptic Systems) och mus-anti-Homer (postsynaptiska markör) (1:500, mus, Synaptic Systems). VIKTIGT: Centrifugera primära antikroppen spädning i 5 minuter vid maximal hastighet på en bänk centrifug för att ta bort utfällda antikropp.
- Tillsätt 200 l primära antikroppen lösning till varje brunn.
- Inkubera över natten vid 4 ° C. Skylten ska placeras i en större behållare som fuktas för att förhindra uttorkning av den primära lösningen. BRYTPUNKT: Celler kan bo i primära antikroppen blandningen i upp till 3 dagar innan du fortsätter med protokollet.
- Följande dag, ta bort primär antikropp från varje brunn och spola brunnar 3 gånger med PBS.
4. Tillämpa sekundär antikropp lösning
- Förbered en sekundär antikropp lösning innehållande ditt sekundära antikroppar utspädd 1:1000 i antikropp buffert innehållande 10% NGS. VIKTIGT: Centrifugera sekundär antikropp spädning i 5 minuter vid maximal hastighet på en bänk centrifug för att ta bort utfällda antikropp. Hoppa över detta steg resulterar i hög sekundär antikropp bakgrund.
Untransfected celler: I avsaknad av en cell etikett, använd Alexa-594 och Alexa-488 konjugerade sekundära för märkning av pre-och postsynaptiska markörer respektive. Till exempel använder vi get-anti-kanin Alexa594 att märka anti-synapsin antikropp och get anti mus Alexa-488 konjugerade sekundära att märka anti-homer antikropp. VIKTIGT: Använd Alexa-488 konjugerade sekundära för primära antikroppar med svagare signal.
Transfekterade celler: Välj sekundära antikroppar att tillgodose excitation utsläpp spektrat av fluorescerande celler etikett. Till exempel när vi märker transfekterade celler med tdTomato vi använder Alexa-647 konjugerat get-anti-kanin att erkänna anti-synapsin antikropp och Alexa-488 konjugerat get-anti-mus att erkänna anti-homer antikropp. Dessutom är användningen av NGS i detta protokoll ett resultat av vårt val av sekundära antikroppar produceras i get. - Tillsätt 200 l sekundär antikropp lösning till varje brunn.
- Efter inkubation i två timmar vid rumstemperatur i en mörk plats, skölj 3 till 4 gånger med PBS.
5. Montering Täckglas
- Mount täckglas i Vectashield monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories Inc, Cat nr:. H-1200) på glasskivor (VWR vetenskapliga, Cat nr:. 48.311-703).
- Applicera försiktigt genomskinligt nagellack runt kanterna på täckglas och låt torka i minst 30 minuter i en torr, mörk plats. VIKTIGT: Undvik att puffa eller flytta täckglas vid tillämpningen av nagellack eftersom detta skulle resultera i sheering av cellerna.
6. Imaging
För bildbehandling är ett fluorescensmikroskop utrustad med en kamera som kan ta bilder på 4 olika kanaler som behövs för att kunna bilden både synaptiska markörer, din cell fylla och kärnor (DAPI / tillval). Celler bör avbildas med en olja mål nedsänkning 63x. Vi bilden med hjälp av Zeiss AxioImager fluorescensmikroskop med Zeiss Plan APOCHROMAT 63x/1.4 Olja DIC ∞ / 0,17 mål.
- Markera celler som är minst två celler diametrar bort från sina närmaste grannar. För att undvika partiskhet och se till slumpmässighet i cellmarkeringen om visualisera untransfected celler markerar celler i DAPI kanalen, sedan ta bilder i alla kanaler. Om visualisera transfekterade celler markerar celler i kanalen som motsvarar den fluorescerande märkningen för att identifiera transfekterade celler (t.ex. tdTomato).
- Skaffa din bilder:
Untransfected celler: För varje markerad cell få 8 bitars bilder i GFP och Texas Red kanaler. Den överlagrade pseudocolored Bilden bör ha din pre-och postsynaptiska markörer i rött och grönt, respektive.
Transfekterade celler: För varje markerade cellen få 8 bitars bilder i GFP, Texas Red och Cy5 (eller Cy5.5) kanaler. Den överlagrade pseudocolored Bilden bör ha din pre-och postsynaptiska markörer i rött och grönt, respektive. Pseudo färg din mobiltelefon fylla i blått.
7. Bildanalys och Co-lokaliserade Puncta Kvantifiering
- Vi använder Puncta Analyzer program för kvantifiering co-lokaliserade synaptisk puncta. Puncta Analyzer koppla in är skriven av Bary Wark, och finns på begäran (c.eroglu @ cellbio.duke.edu). Puncta Analyzer körs i ImageJ 1,26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/, nyare versioner av ImageJ kan inte köra programmet). För att installera Puncta Analyzer plats helt enkelt det nedladdade programmet mapp i "Plugins" mappen i ImageJ 1,26 katalogen.
- Öppna en av dina bilder med hjälp ImageJ. Använd någon av valet verktyg i imagEJ menyn för att avgöra regionen av intresse (ROI). Vi använder regelbundet den runda markeringsverktyget för att markera ett område ungefär en cell diameter radiellt runt soma av intresse.
- Med din region av intresse (ROI) väljs, gå till plugins-menyn och välj "Puncta Analyzer".
- I "Analys Options"-fönstret som visas väljer du "Red Kanal", "Green Kanal", den första "Subtrahera Bakgrund" och "resultat som fil ...." Klicka på "OK". Du blir ombedd att ange en plats att spara dina resultat i. Dessa resultat kan exporteras till Excel för vidare analys.
- I fönstret som visas bredvid, se en rullande boll radie av 50 är vald och avmarkera "Vit bakgrund" alternativet (denna modifiering är inte nödvändigt, men ofta föredras av användarna av ansökan för att underlätta visualisering). Klicka på "OK".
- Ett nytt fönster kommer att visas tillsammans med en mask som motsvarar dina röda kanalen bilden. Justera tröskeln tills du känner att den röda masken överensstämmer så bra som möjligt till så många diskreta individuella puncta utan att introducera alltför mycket buller. Detta är en av de mest subjektiva stegen i detta protokoll, så noga med att utveckla en konsekvent strategi. Klicka på "Klar". Ställ in den minsta puncta storlek till 4 pixlar och ändra inget annat. Klicka på "OK".
- Upprepa föregående steg, denna gång för den gröna kanalen.
- När du är klar med föregående steg kommer insticksmodulen lämnat kvantifierade motsvarande puncta i varje kanal separat och att colocalized puncta mellan de två kanalerna.
HJÄRNAN avsnitt:
Synapsen analysen kan tillämpas på kryosnitt från hjärnan, och till andra centrala nervsystemet (t ex ryggmärgen eller näthinna) förutsatt att det finns ett lämpligt pre-och postsynaptiska markörer par (med antikroppar som fungerar bra i sektioner) som kan utnyttjas för att identifiera synapser som du vill att kvantifiera. Synapsen analysen kan avslöja den temporala regleringen av synaps bildas i en viss hjärna region och kan kvantifiera effekter på synaptisk anslutning i transgena djur eller i ett prov som har manipulerats på något annat sätt.
1. Skörd hjärnvävnad från mus
Alla djur förfaranden bör göras i överensstämmelse med IACUC djur protokoll.
- Euthanize möss genom exsanguination och perfusion med PBS. Perfusion med PBS är avgörande för borttagning av blod och kommer att minska bakgrunden signal för färgning förfaranden. VIKTIGT: Använd inte BEGJUTA med fixativ t.ex. 4% PFA. Detta kommer att negativt påverka färgning resultat.
2. Fixering
- Fäst hela hjärnan hos 4% PFA i PBS vid 4 ° C över natten. Nästa dag skölja hjärnan 3 gånger med PBS.
- Cryoprotect hjärnan genom att placera dem i 30% sackaros i PBS. Vävnaden kommer inledningsvis att flyta. Förvara vid 4 ° C tills vävnaden sjunker till botten. I detta skede cryoprotection är klar.
3. Bädda / Cryosectioning
- Bädda hjärnor i önskad riktning för sektionering (t.ex. sagittalt eller koronalt) i en 2:01 lösning av 30% sackaros: (. Tissue-Tek, Cat nr: 4583) oktober i PBS. Freeze inbäddade hjärnor på en plan yta av torr is. Fryst inbäddade hjärnor kan placeras i fryspåsar och förvaras vid -80 upp till ett år innan snittning.
- Cryosection vävnaden i 12-16μm sektioner och montera på glasskivor (Sigma, Cat nr:. S4651). Diabilder kan lagras upp till en vecka vid -80 ° C före färgning.
- Diabilder ska färgas bör torkas vid 37 ° C i 30 minuter och sköljas 1x med PBS för att avlägsna rester oktober
4. Blockering Sektioner
- Blockera sektioner i 20% normal get serum (NGS) i PBS i en timme vid rumstemperatur. VIKTIGT: Ta inte med Triton X-100 i detta skede. Före tillsats av den blockerande lösningen, kan du skapa en hydrofob barriär runt avsnitten om bilden med hjälp av en Elite PAP Pen (DBS, Cat nr:. K039)
5. Tillämpa primära antikroppar
- Späd din primära antikroppar i PBS med 0,3% Triton och 10% NGS.
- I hjärnan avsnitt använder vi PSD-95 (Zymed, Kanin, 1:500) att märka glutamaterg postsynaptiska fack och VGlut1 eller VGlut2 (Chemicon, marsvin, 1:2500) att märka glutamaterg presynaptiska terminaler. Centrifugera primära antikroppen spädning i 5 minuter vid maximal hastighet på en bänk centrifug för att ta bort utfällda antikroppar om det finns.
- Inkubera avsnitt i primära antikroppen lösning för 36-60 timmar vid 4 ° C.
6. Använda sekundära antikroppar
- Tvätta den primära antikroppen bort genom att sänka ner bilderna 3x i PBS i 15 minuter vardera. Efter detta steg se till att skydda dina bilder från direkt ljus.
- Spädsekundära antikroppar vid en utspädning av 1:200 i samma buffert beskrivs som för primära antikroppar. Till exempel för VGlut/PSD95 färgning vi använder get anti marsvin Alexa 488 (Vglut) och get anti kanin Alexa 594 (PSD-95) (Invitrogen).
- Inkubera avsnitt i sekundär antikropp lösning för 2 timmar vid rumstemperatur i mörker.
- Tvätta obundna sekundära antikroppar av bilderna genom att sänka ner bilderna 4x i PBS i 15 minuter vardera.
7. Montering
- Tillsätt små droppar av Vectashield monteringsmedium med DAPI (Vector Laboratories Inc.) på glasskivor (VWR vetenskapliga) och sedan täcka glasen med täckglas (VWR vetenskapliga, nr 1,5, 48.393 241). Applicera nagellack för att förhindra förflyttning av täckglas.
8. Imaging
VIKTIGT: En konfokalmikroskop med minst 3 kanaler krävs för avbildning beskrivs här. Vi bilden på en Leica SP5 laser-scanning konfokalmikroskop med ett 63x objektiv oljeimmersion.
- Synaptic hjärnan av intresse bör väljas för skanning konsekvent mellan sektionerna. Till exempel, i vår synapsen analys av näthinnans synapser gangliecell på överlägsen collicular nervceller, vi bild den yttre överlägsna collicular regionen som gränsar till sämre colliculi som omfattar synaptiska lagret som tar emot retinocollicular terminaler 7,8,9. Vi bild och kvantifiera synapserna i den övre 150 ìm synaptisk zon av den överlägsna colliculi där RGC: er är kända för att skapa synaptiska kontakter 9.
- För varje avsnitt i både 488 och 594 kanaler, vi bilden seriell optisk sektioner på 0,33 ìm mellanrum under ett totalt djup på 5 ìm för totalt 15 optiska sektioner. Minst 3 sektioner från varje djur skall avbildas och minst tre djur måste tas med från en viss experimentell skick.
- Maximal stödnivå prognoser (MIPs) genereras från grupper av 3 på varandra följande avsnitten ger 5 minimiimportpriser representerar 1μm djup vardera. Dessa MIPs kvantifieras.
9. Bild Kvantifiering
- Kan utföras exakt som beskrivs för RGC: er, men den form och storlek på ROI kommer att förändras som en funktion av vilken region av de bilder som du vill att kvantifiera.
Nycklar till framgång:
Renat RGC: er:
- Före fastställande renade RGC: er (eller andra dissocierade kultur) se till att förvärma 4% PFA i vattenbad inställt på 37 ° C i ~ 20-25 minuter (förvaras vid 4 ° C vid alla andra tider, använd inte PFA spädningar äldre än 7 dagar).
- Särskilt för odlade nervceller, är det lämpligt att inte använda en dammsugare aspirator under tvättar för alla skölj steg. Skonsammare metoder som att använda en pasteurpipett och ett sug glödlampa förbättras märkbart kvaliteten på din färgning.
- Var noga med att inte låta dina celler torka ut under din spola steg.
- Undvik knuffar eller flytta din täckglas vid tillämpning av nagellack eftersom detta kan resultera i klippning av cellerna på täckglas.
- Spin ner alla primära och sekundära antikroppar att eliminera utfällda antikroppar som negativt kommer att påverka färgning.
- Se till att välja primära antikroppar för din pre-och postsynaptiska markörer upp i olika arter. Underlåtenhet att göra detta kommer att eliminera din förmåga att skilja mellan de två signalerna efter applicering av sekundära antikroppar.
Brain sektioner:
- Inte BEGJUTA din mus med fixativ, såsom PFA.
- Ta inte med Triton-X-100 i din blockerande lösningen för hjärnans sektioner. Gör det skadar kvaliteten på färgning av presynaptiska markörer, särskilt presynaptiska markörer som är förknippade med synaptiska blåsor.
- Användning av ett konfokalmikroskop för avbildning krävs för bild förvärv som är av tillräckligt bra kvalitet för att utföra en synaps analys.
Representativa resultat:
Synapsen analys som beskrivs ovan är utformad för att fånga upp förändringar i synaptiska anslutningsmöjligheter in vitro och in vivo. I vårt labb använder vi synapsen analys för att fastställa effekten av antingen enskilda eller flera astrocyternas-utsöndras molekyler på synaps bildning. Vi utför ofta denna synaps analys på renat RGC: er som vi kulturen in vitro.
En väl beskrivna effekten av kronisk tillämpning av astrocyternas med luftkonditionering media (ACM) i renad RGC kulturer är en multipel-faldig ökning i antalet synapser som bildas mellan RGC: er 3,4,5,6. Figur 1A och 1B visar representativa bilder av untransfected renat RGC: er som behandlades med antingen basal tillväxt media eller med ACM. Efter färgning för excitatoriska pre-och postsynaptiska markörer, ACM-inducerad ökning av synapse formation är kvalitativt uppenbara (Figur 1A, 1B). Faktum är att detta fynd har bekräftats av flera studier som har använt elektrofysiologi för att visa att ACM-inducerad synapser är funktionella och elektronmikroskopi för att visa att synapserna är ultrastructurally normala 3,4,6. Övrigt arbete i vårt laboratorium har identifierat den underavdelning kalciumantagonister α2δ-1 som neuronala receptorn för ett starkt synaptogenic astrocyternas-utsöndras molekyl, thrombospondin 3. Här kan vi redovisa resultaten av ett experiment i renat RGC: er som utfördes för att avgöra om ökade nivåer av α2δ-1 ökar ytterligare ACM-inducerad synaps bildning (Figur 3).
RGC: er var cotransfected med antingen en tom vektor eller med en konstruktion kodning α2δ-1 med en separat konstruktion kodning tdTomato efter 5 dagar in vitro (DIV5). Efter kronisk behandling med antingen ACM eller GM, var RGC: er fasta och färgas på DIV 11. Efter immunolabeling av pre-och postsynaptiska markörer för retande synapser ser vi ett kvalitativt mycket större synapsen antal i renat RGC: er som antingen uttrycker en tom vektor (pcDNA3.1) eller α2δ-1 (Fig 1c, 1d). Vi kvantifiera synaptogenic effekten av ACM använda Puncta analysator att räkna synaps nummer (Fig. 2) i minst 15 neuroner från varje tillstånd. Ett urval av denna storlek ger oss möjlighet att beräkna det genomsnittliga antalet synapser per neuron och hitta ett statistiskt signifikant, ~ 10-faldig ökning av synapser bildas av ACM-behandlade nervceller som uttrycker en tom vektor (Fig. 3, grå staplar). Dessutom visar vi att överuttryck av α2δ-1 leder till en betydande potentiering av ACM-inducerad synaps bildning (~ 20-faldigt. Fig. 3, svarta staplar).
Förutom odlade nervceller, kan vi kvantifiera synaptisk densitet i olika områden i hjärnan med hjälp av denna teknik. Den överlägsna colliculi är en struktur i hjärnan som tar emot retinocollicular prognoser, med ursprung från RGC: er i näthinnan 7,8,9. Under postnatal utveckling, ökar antalet retande synapser bildas av RGC: er på sina mål i den överlägsna colliculi dramatiskt från P7 till P21 7,8,9.
Med vår kvantifiering teknik, visar vi att antalet retinocollicular synapser bildas i överlägsen colliculi ökar från P7 till P14. För att göra detta, kvantifieras vi synaptisk densitet vid P7 och igen vid P14. Vi fläcken den överlägsna colliculi för PSD-95 (postsynaptiska) och för VGlut2 (presynaptiska markör är specifik för RGC synapser i överlägsen colliculi). Den yttre synaptiska regionen överlägsen colliculi var avbildade (fig. 4A) och co-lokaliserade VGlut2/PSD-95 synapser kvantifierades (Fig. 4B, 4C) från minst 3 sektioner per djur och från minst tre djur per tidpunkt. Kvantifiering av de framtagna uppgifterna visar tydligt en över tre gånger betydande ökning av antalet synapser mellan P7 och P14. Dessa resultat överensstämmer med tidigare publicerade fynd som använder elektronmikroskopi (Figur 4D) 9.
Sammanfattningsvis är metoden för synapsen antal kvantifiering beskriver vi här ett användbart verktyg för att bestämma synaps antal och täthet i kultur och i neurala vävnader, så att vi kan studera effekterna av att manipulera synaps bildas in vitro eller in vivo.
Figur 1: Representativa synaptic färgning i renat RGC: er. (A och B) 3 dagar in vitro (DIV) RGC: er odlades antingen (A) basal tillväxt media (GM) eller (B) pro-synaptogenic mus astrocyternas betingad media (ACM) i ytterligare 6 dagar. Cellerna var då märkta för fagott (presynaptiska, röd) och Homer (postsynaptisk, grön). Mus ACM stimulerar starkt synapsen bildas mellan RGC: er som bestäms av ökningen av antalet co-lokaliserade fagott och Homer puncta. (C och D) 5DIV RGC: er var transfererats med en plasmid som överuttrycker subenheten kalciumantagonister α2δ-1. Transfekterade celler som identifierades med ett tdTomato cell fyllning (blå) och har målat på presynaptiska markör synapsin och postsynaptiska markörer Homer. Pilarna anger synapser. Skala stapel representerar 20 mikrometer.
Figur 2:. Kvantifiering av synaps nummer med Puncta Analyzer Visas här är ett exempel (a) en ursprungliga bilden av en ren retinal ganglion celler överuttryckte thrombospondin receptorn α2δ-1 och färgas för presynaptiska markör synapsin och postsynaptiska markörer Homer. (B) Bilder motsvarar de masker som skapats i varje kanal när man analyserar puncta i Puncta Analyzer. (C) Puncta Analzyer kommer att skapa en bild som den som visas här i vilken puncta markeras med små svarta prickar (infälld). Även shoWN är (d) den numeriska utdata från programmet där puncta nummer tillsammans med flera andra parametrar finns i textform / numerisk form (fetstil tillagd för betoning).
Figur 3:. Representativt resultat för synaps-analysen Här visas synaptogenic effekten av kronisk behandling av RGC: er med astrocyternas med luftkonditionering media (ACM) i transfekterade RGC: er som antingen uttrycker tom vektor (pcDNA3.1, grå staplar) eller thrombospondin receptor α2δ-1 . Felstaplar representerar SEM. GM = Tillväxt Media. ACM = (Rat) astrocyternas Contitioned Media.
Figur 4:. Kvantifiering av synaptisk densitet i musen överlägsen colliculi (a) För att bestämma utvecklingsmässiga förändringar i antalet glutamaterg synapser som fastställts av RGC: er på sin överlägsna collicular mål i gnagare hjärnan, färgade vi kryosnitt från mus hjärnan med antikroppar mot det presynaptiska markör VGlut2 (grön) och den postsynaptiska markör, PSD-95 (röd). Vi avbildade den yttre 150 x 150 ìm region av musens överlägsna colliculi (SC) som motsvarar det synaptiska målregion för RGC: er med hjälp av en laserskanning konfokalmikroskop. Ett z-stack för varje fm avsnitt har samlats för totalt djup på 5 ìm (15 x 0,33 ìm optisk avsnitt). Maximal bild prognoser (MIPs) genererades för grupper av tre i rad optiska sektioner vilket ger 5 mips / avsnitt var och en representerar 1 mikrometer djup. Nedan är en representant minimiimportpris tas från överlägsna colliculi av en P14 WT mus. Den presynaptiska markör, VGlut2, visas i grönt och postsynaptiska markör, PSD-95, visas i rött. (C) Numeriska utdata som produceras av Puncta Analyzer. (D) Kvantifiering av analysen av synapsen nummer i minst 3 sektioner per djur med tre djur per tidpunkt (felstaplar representerar SEM). Skala stapel representerar 50 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Synapsen analys som beskrivs ovan är baserad i samband med våra experimentella mål, där vi fokuserar till stor del på excitatoriska projektioner av RGC: er, antingen renas kultur eller i hjärnans avsnitt. Vi har lämnat en hänvisning antikroppar tabell över som fungerar bra för märkning retande synapser (tabell 1).
Denna synaps analys kan anpassas för att kvantifiera synaps på alla neuronala befolkning eller någon annan synaptiska subtyp som det är en selektiv pre-och postsynaptiska markörer. Till exempel beskrev synapsen analysen här kan användas till att studera GABA-ergic (i motsats till glutamaterg) synapserna med hjälp av lämpliga pre-och postsynaptiska markörer 10,11.
Denna synaps analys är ett viktigt verktyg för laboratorier undersöka förändringar i synaptiska förbindelser mellan nervceller. Även om det är nödvändigt för att bekräfta resultaten av denna analys med elektronmikroskopi och elektrofysiologi, ger det ändå ett relativt enkelt sätt att besvara viktiga frågor om den molekylära signaler som modulerar en nervceller förmåga att bilda synapser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Puncta Analyzer Plug-in för Image J är skriven av Barry Wark (nuvarande adress: Physion Consulting) i labbet av Ben A. Barres (Stanford University).
Finansiering;
- Alfred P. Sloan Foundation
- Den Ester A. och Joseph Klingenstein fonden, Inc.
- Bred Biomedical Research Foundation
- Cure för Huntingtons s Disease Initiative
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) | Mouse | Monoclonal |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lysine | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-well culture plate | Falcon BD | 35-3047 | |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | --- | |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR international | 48393241 | |
| Glass slides | VWR international | 48311-703 | |
References
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
