Summary
이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.
Abstract
신경 과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 버렸네 형성의 초기 단계를 지시 분자 신호를 이해하는 것입니다. 따라서 그것은 시냅스 연결에 변화를 수치 객관적 방법을 개발하기 위해 필수적이되었습니다. 샘플 고정부터,이 프로토콜의 세부 내용은 방법 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 수치. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다. 이 colocalizations의 수는 ImageJ 분석 소프트웨어 플랫폼에 따라 Puncta 분석기 (요청시 가능합니다 바리 워크, c.eroglu @ cellbio.duke.edu 작성한)에 플러그를 사용하여 계량입니다. 이 프로토콜에 설명되어 버렸네 분석은 선택적 사전 및 postsynaptic 마커를 가지고있는 신경 조직이나 문화를 준비 적용할 수 있습니다. 이 버렸네 분석이 널리 시냅스 개발 연구에 활용할 수있는 귀중한 도구입니다.
Protocol
준비하는 솔루션 :
- 항체 버퍼 :
- 150 MM NaCl
- 50 MM - 트리스베이스 (피셔, 고양이 번호 :. BP152 - 5, 50 ㎜) - 1.21 g
- 1퍼센트 BSA (시그마, 고양이 번호 :. A2153, 1 %) - 2.0 g
- 100 MM L - 라이신 (시그마, 고양이 번호 :. L - 1137, 100 ㎜) - 3.65 g
- 7.4으로 산도를 조정
- 0.04 %의 Azide
- 소주 H 2 O. 200 ML에 볼륨을 조정
- 0.22μm 필터를 통해 필터 (Millipore, 고양이 번호 :. SCGPU02RE).
- PFA Diluant :
- 168 ML 0.5 M 나 2 HPO 4 (이염)
- 72 ML 0.5M 나 2 HPO 4 (일염기의)
- 660 ML 증류수 H 2 O
- 교양 뉴런 (솔루션 # 2) 4퍼센트 PFA의 정착액 :
- 10 ML 16% PFA 솔루션 (전자 현미경 과학, 고양이 번호 :. 15711)
- 30 ML 4% PFA diluant (솔루션 # 2)
- 4퍼센트 PBS의 PFA :
- 4g PFA (전자 Microscropy 과학, 고양이 번호 :. 19210)
- 100 ML PBS (Invitrogen, 고양이 번호 :. 20012-027)
- 40 열 ° C, 밤새 저어.
- 0.22μm 필터 (. : SCGPU02RE Millipore, 고양이도없는)를 통해 필터
- 차단 버퍼 (총 볼륨 (24 잘 접시) = (# coverslips +1) X 200μl)
- 50 % 항체 버퍼 (솔루션 # 1)
- 50% 정상 염소 혈청 (Gibco, 고양이 번호 :. 16210)
- 0.2 % 트리톤 X - 100 (로체 진단 GMBH, 고양이 번호 :. 9002-93-1)
- PBS의 30 % 자당
- 30g의 자당 (MP의 Biomedicals (주), 캣 번호 :. 821713)
- 70 ML PBS (Invitrogen, 고양이 번호 :. 20012-027)
- 자당은 솔루션에까지 stirbar와 함께 섞는다.
- PBS와 100ml로 볼륨을 가지고
- 0.22 μm의 필터 (. : SCGPU02RE Millipore, 고양이도없는)를 통해 필터
의 연결을 문화 준비 :
(팔콘, 35-3047) 24 - 잘 접시에 : 여기에 설명된 프로토콜은 12mm 유리 coverslips (99010. 칼 헥트 번, O, 고양이도없는)에 성장하는 기본의 연결을 문화에 적용됩니다. 예를 들어, 우리 연구실에 우리는 문화 쥐 망막 신경절 세포 (RGCs)는 P5 - 7 동물 1,2에서 수확의 쥐 망막에서 정화. 전지는 폴리 - D - 라이신 (. 시그마, 캣 번호 : P6407)와 코팅 유리 coverslips에서 재배되지 않습니다 (. Cultrex, 고양이도없는 : 3400-010-01)는 마우스 laminin. 우리는 버렸네 분석에 대해 서로 다른 방법으로 몇이 문화 준비를 활용. 우리가 수행하는 하나의 조작 astrocyte - 분비 synaptogenic 요인의 존재 또는 부재의 중 culturing의 RGCs을 포함한다. 또한, 우리는 RGCs가 관심의 단백질을 overexpress에 transfected되었습니다 실험에서 이러한 다양한 치료 조건을 사용합니다. 후자의 경우, 우리는 세포 레이블 (예 : GFP 또는 tdTomato)와 세포를 공동 transfect. 이러한 서로 다른 실험 방법 하나는 우리가 아래에 명확히 버렸네 분석의 특정 단계를 수행하는 방법에 영향을 미칩니다.
1. Dissociated 정화 RGCs를 고정
- RGC 함유 웰스의 문화 미디어를 제거하고 500 μl (24 잘 접시) 4 % paraformaldehyde (PFA)를 추가 ° C 각 잘하는 37 prewarmed. 세포가 실온 7 분 수정하실 수 있습니다.
- 다음 고정과 함께 세포 3 번 씻어 인산염 버퍼 호수 (PBS) (Invitrogen, 고양이 번호 :. 20012-027). 중요 : 버퍼는 다음 버퍼로 잘 그것이 즉시 교체해야합니다에서 제거되면 세포가, 우물에서 액체 않고 남아해서는 안됩니다. 이 시점에서, 세포는 immunostaining 준비하고 있습니다.
2. RGCs에 Unspecific 바인딩 사이트 차단
- 와 0.2 % 트리톤 X - 100 (로체 진단 GMBH, 고양이 아냐. : 9002-93-1). : 50 % 정상 염소 혈청 (. 16,210 NGS, Gibco, 고양이도없는)가 포함된 버퍼를 차단 준비 각 우물에서 PBS를 제거 후, 실온에서 30 분 각각 잘하고 차단할 수있는 차단 버퍼 200 μl를 추가합니다.
- 차단 버퍼를 제거하고 PBS로 3 번 씻어.
3. 차 항체 솔루션 적용
- 중요 : 종에서 얻을 수 있습니다 예약 및 postsynaptic 마커에 대한 기본 항체를 선택하셔야합니다.
- 90 % 항체 버퍼, 선택의 사전과 postsynaptic 항체 쌍을 포함하는 10 % NGS 솔루션의 주요 항체 희석을 준비합니다. 예를 들어 토끼 방지 synap에 대한죄 (presynaptic 마커) (1:750, cytosolic 도메인, 시냅틱 시스템)와 마우스 안티 - 호머 (postsynaptic 마커) (1:500, 마우스, 시냅틱 시스템). 중요 : 모든 시켰던 항체를 제거하는 벤치 톱 원심 분리기의 최대 속도로 5 분 차 항체 희석을 원심 분리기.
- 각 물론 200 μl 차 항체 솔루션을 추가합니다.
- 4 밤새 품어 ° C. 접시는 기본 솔루션의 건조 방지하기 humidified있는 큰 용기에 배치해야합니다. 포인트 BREAK : 세포는 프로토콜을 계속하기 전에 최대 3 일 동안 차 항체 혼합물에 머물 수 있습니다.
- 그 다음날, 각 우물에서 기본 항체를 제거하고 PBS로 우물 3 번 씻어.
4. 차 항체 솔루션 적용
- 10 % NGS를 포함하는 항체 버퍼에 1:1000 희석 보조 항체를 포함하는 보조 항체 솔루션을 준비합니다. 중요 : 시켰던 항체를 제거하는 벤치 최고 원심 분리기의 최대 속도로 5 분 차 항체 희석을 원심 분리기. 높은 이차 항체 배경이 단계에서 결과를 스키핑.
Untransfected 전지 : 전지 라벨의 부재에서, 알렉사 - 594 각각 미리와 postsynaptic 마커를 라벨에 대한 알렉사 - 488 복합 secondaries를 사용합니다. 예를 들어, 우리는 안티 마우스 알렉사 - 488 복합 보조 안티 - 호머 항체를 라벨에 방지 synapsin 항체와 염소를 라벨 안티 - 토끼 Alexa594 염소를 사용합니다. 중요 : 사용 알렉사 - 488 약한 신호를 기본 항체에 대한 복합 secondaries.
Transfected 세포 : 귀하의 형광 셀 라벨의 여기 - 방출 스펙트럼을 수용 차 항체를 선택합니다. 예를 들어, 우리가 tdTomato와 transfected 세포 레이블을 때 사용 알렉사 - 647 복합 백신 synapsin 항체를 인식하고 알렉사 - 488 복합 방지 호머 항체를 인식 염소 방지 마우스.에 염소 방지 토끼 또한,이 프로토콜에 NGS의 사용은 염소에서 생산 보조 항체 우리의 선택의 결과입니다. - 각 물론 200 μl 차 항체 솔루션을 추가합니다.
- 어두운 장소에 실온에서 두 시간 동안 잠복기 후, PBS로 3-4 번 씻어.
5. 장착 Coverslips
- 유리 슬라이드 (. : 48311-703 VWR 과학, 고양이도없는)에 : Vectashield에 마운트 coverslips는 DAPI (H - 1200. 벡터 연구소 주식 회사, 고양이도없는)와 매체를 장착.
- 부드럽게 coverslip의 가장자리 주위에 투명 매니큐어를 적용하고 건조하고 어두운 장소에서 적어도 30 분 동안 건조하실 수 있습니다. 중요 : 세포의 쉬어링을 초래 하리라는 사실을 이끌어하거나이 때문에 매니큐어의 신청 중에 coverslips를 이동하지 마십시오.
6. 이미징
이미징 들어, 4 개의 채널에서 사진을 찍을 수있는 카메라가 장착된 형광 현미경 이미지 모두 신경 마커를 수 있도록 필요한, 휴대폰은 (DAPI / 옵션) 입력하고 핵. 전지는 석유 침지 63x 목표를 사용하여 몇 군데해야합니다. 우리 자이스 혈구 계획 - 고차 색지움 63x/1.4 오일 DIC ∞ / 0.17 목적으로 자이스 혈구 AxioImager 형광 현미경을 사용하여 이미지.
- 적어도 두 셀 직경 떠나 자신의 가장 가까운 이웃에서 온 세포를 선택합니다. 편견을 방지하고 untransfected 세포 시각, DAPI 채널에서 셀을 선택하면 셀 선택의 임의성을 보장하기 위해 다음 모든 채널의 이미지를 가져가라. 시각 transfected 세포 transfected 세포를 (예 : tdTomato)를 식별하기 위해 형광 라벨에 해당하는 채널의 세포를 선택하면.
- 이미지를 취득 :
Untransfected 셀 : 선택한 각 셀에 들어, GFP와 텍사스 레드 채널에 8 비트 이미지를 구하십시오. 겹쳐 pseudocolored 이미지는 각각 빨강, 녹색에서 - 사전 및 postsynaptic 마커가 있어야합니다.
Transfected 세포 : 선택한 각 셀에 대해 GFP, 텍사스 레드와 Cy5 (또는 Cy5.5) 채널에서 8 비트 이미지를 구하십시오. 겹쳐 pseudocolored 이미지는 각각 빨강, 녹색에서 - 사전 및 postsynaptic 마커가 있어야합니다. 의사 컬러 휴대폰이 파란색으로 입력합니다.
7. 이미지 분석과 공동화된 Puncta의 부량
- 우리는 부량 공동화된 시냅스 puncta에 대한 Puncta 분석 프로그램을 사용합니다. 에 Puncta 분석기 플러그인 바리 워크에 의해 쓰여진, 그리고 요청 (c.eroglu @ cellbio.duke.edu)에 따라 사용할 수 있습니다. Puncta 분석기 ImageJ 1.26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/, 최신 ImageJ 버전의 응용 프로그램을 실행할 수 없습니다)에서 실행됩니다. 설치하려면 Puncta 분석기는 단순히 ImageJ 1.26 디렉토리에서 "플러그인"폴더에 다운로드한 응용 프로그램 폴더를 놓습니다.
- ImageJ를 사용하여 이미지 중 하나를 엽니다. Imag에서 선택 도구 중 하나를 사용하여EJ 메뉴의 관심 영역 (ROI)을 확인합니다. 우리는 정기적으로 약 한 세포 직경 반경 관심의 소마 주변 지역을 선택 원형 선택 도구를 사용하십시오.
- 관심의 영역 (ROI)가 선택된 상태에서 플러그인 메뉴로 가서 "Puncta 분석기"를 선택하십시오.
- 나타나는 "분석 옵션"창에서 "레드 채널", "그린 채널"최초의 "빼기 배경"및 "설정 결과 파일을 선택 ...." "확인"을 클릭하십시오. 당신은이 결과가 더 분석을 위해 Excel로 내보낼 수 있습니다 인치 결과를 저장할 위치를 지정하라는 메시지가 나타납니다.
- 옆에 나타나는 창에서, 50 롤링 볼 반경이 선택되어 있는지 확인하고 선택을 취소 "흰색 배경"옵션 (이 수정이 필요하지 않지만 종종 시각의 용이성을 위해 응용 프로그램의 사용자가 선호됩니다.) "확인"을 클릭하십시오.
- 새 창이는 빨간색 채널 이미지로 대응하는 마스크와 함께 나타납니다. 당신은 빨간 마스크가 너무 많은 소음을 도입하지 않고 많은 이산 개인 puncta로뿐만 아니라 가능한 한 일치한다고 생각까지 임계값을 조정합니다. 이것은이 프로토콜의 가장 주관적 단계 중 하나이기 때문에, 일관된 접근 방법을 개발하는데주의를 기울여야. "완료"를 클릭하세요. 4 픽셀에 최소 puncta 크기를 설정하고 다른 아무것도 수정하지 않습니다. "확인"을 클릭하십시오.
- , 더 그린 채널이 시간을 이전 단계를 반복합니다.
- 일단 이전 단계를 완료, 플러그인은 별도로 각 채널에 puncta에 해당하는 부량를 제공하고 두 채널 간의 colocalized puncta하는 것입니다.
뇌 섹션 :
버렸네 분석을 수있는 적합한 사전 및 postsynaptic 마커 쌍을합니다 (섹션에서 잘 작동 항체와)있다는 것을 머리에서 cryosections에 적용하고, 다른 신경계 조직 (예 : 척수 또는 망막)에 제공될 수 있습니다 당신은 계량하고자하는 시냅스를 식별하는 이용. 버렸네의 분석은 주어진 두뇌 지역의 버렸네 형성의 시간적 규정을 공개하고 유전자 변형 동물 또는 다른 방식으로 조작되어 샘플에서 시냅스 연결에 대한 효과를 계량하실 수 있습니다.
1. 마우스의 뇌 조직을 수확
모든 동물 절차 IACUC 동물 프로토콜과 일치에 이루어져야합니다.
- PBS로 과다 및 재관류에 의해 생쥐를 안락사. PBS로 관류 혈액의 제거를 위해 중요하며 얼룩 절차에 대한 배경 신호를 줄일 수 있습니다. 중요 : 이러한 4퍼센트 PFA로 fixatives와 perfuse하지 마십시오. 이것은 부정적인 얼룩 결과에 영향을 미치지 않습니다.
2. 정치
- 4 ° C 하룻밤에 PBS에 4퍼센트 PFA의 전체 머리를 수정. 그 다음날은 두뇌에게 PBS로 3 번 씻어.
- PBS의 30 % 자당에 그들을 배치하여 두뇌 Cryoprotect. 조직 처음 부동합니다. 4 유지 ° 조직이 아래로 싱크까지 C. 그 단계에서 cryoprotection가 완료됩니다.
3. 퍼가기 / Cryosectioning
- 30 % 자당의 2시 1분 솔루션 (예 : 화살 또는 코로나) sectioning에 대해 원하는 방향에서 머리를 삽입 번호 : (. 조직 테크, 고양이도없는 : 4583) OCT PBS 인치 드라이 아이스의 평평한 표면에 포함된 머리를 고정. 냉동 임베디드 두뇌는 냉동실 가방에 위치하고 sectioning 전에 년 -80에서 보관하실 수 있습니다.
- Cryosection는 12 16μm 섹션으로 조직과 (시그마, 고양이 아냐. : S4651) 유리 슬라이드에 탑재합니다. 슬라이드는 -80 ° C 이전에 얼룩을에서 주일까지 저장할 수 있습니다.
- 얼룩하는 슬라이드는 30 분 동안 37 ° C에서 건조 및 잔류 OCT를 제거하는 PBS와 1X를 씻어서해야합니다.
4. 차단 섹션
- 실온에서 한 시간 만이라도 PBS에 최고 20 % 정상 염소 혈청 (NGS)의 부분을 차단합니다. 중요 :이 단계에서 트리톤 X - 100를 포함시키지 마십시오. 전에 차단 솔루션뿐만 아니라, 당신은 엘리트 PAP 펜 사용하여 슬라이드의 섹션 주위에 소수성 장벽을 만들 수 없습니다 (DBS, 고양이를 아니요. K039)을
5. 차 항체를 적용
- 0.3 % 트리톤와 10 % NGS와 PBS의 기본 항체를 희석.
- 뇌 섹션에서 우리는 glutamatergic presynaptic 터미널 라벨 glutamatergic postsynaptic 구획 및 VGlut1 또는 VGlut2을 (Chemicon, 기니 돼지, 1:2500) 라벨 (Zymed, 래빗, 1:500) PSD - 95를 사용합니다. 만약 존재한다면 시켰던 항체를 제거하는 벤치 최고 원심 분리기의 최대 속도로 5 분 차 항체 희석을 원심 분리기.
- 4 36-60시간에 대한 기본 항체 용액에 부화 섹션 ° C.
6. 차 항체를 적용
- 십오분 각 PBS의 슬라이드가 3 배 immersing하여 기본 항체를 씻으십시오. 이 단계 후에 직접 빛으로부터 슬라이드를 보호해야합니다.
- 묽게하다동일한 버퍼 1:200의 희석에 보조 항체는 일차 항체에 대해 설명했다. VGlut/PSD95 얼룩 예를 들어 우리는 염소 방지 기니 돼지 알렉사 488 (Vglut)과 염소 백신 토끼 알렉사 594 (PSD - 95) (Invitrogen)을 사용합니다.
- 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 차 항체 용액에 섹션을 품어.
- 십오분 각 PBS에있는 슬라이드 4X immersing하여 슬라이드에서 언바운드 차 항체를 씻으십시오.
7. 설치
- 유리 슬라이드 (VWR 과학)에 DAPI (벡터 연구소 주식 회사)와 매체를 장착 Vectashield 작은 방울을 추가하고 다음 coverslips (VWR 과학, 번호 1.5, 48393 241)와 함께 슬라이드를 커버. coverslips의 움직임을 억제하기 위해 폴란드어 손톱을 적용합니다.
8. 이미징
중요 : 적어도 3 채널 공촛점 현미경 여기서 설명하는 이미지가 필요합니다. 63x 기름 침지 목표를 사용하여 Leica SP5 레이저 스캐닝 공촛점 현미경에 우리는 이미지.
- 관심 시냅스 뇌 영역은 섹션 사이의 일관성 검사를 위해 선택되어야합니다. 예를 들어, 우수한 collicular의 뉴런에 망막 신경절 세포의 시냅스 우리의 버렸네 분석에서, 우리는 이미지 retinocollicular 터미널 7, 8, 9를받는 신경 레이어를 포함 하부 colliculus에 인접한 외부 뛰어난 collicular 지역을. 우리는 이미지와 그 상부 150 μm의 RGCs가 시냅스 접촉에게 9 확립하는 것으로 알려져있는 우수한 colliculus의 시냅스 영역에서 시냅스를 계량.
- 각 섹션에 모두 488 및 594 채널, 우리는 15 광학 섹션 총 5 μm의 총 깊이를 통해 0.33 μm의 간격으로 이미지를 직렬 광학 섹션. 각 동물에서 적어도 3 섹션은 몇 군데해야하며 적어도 3 동물은 주어진 실험 조건에서 포함되어야합니다.
- 최대 강도 예측 (MIPS)는 깊이 각각 1μm를 나타내는 5 MIPS를 항복 연속 3 섹션의 그룹에서 생성됩니다. 이러한 MIPS는 계량입니다.
9. 이미지 부량
- RGCs에 대한 설명으로 정확하게 수행할 수 있습니다, 그러나 투자 수익 (ROI)의 모양과 크기가 어느 지역이 계량하고자하는 이미지의 함수로 변경됩니다.
성공에 열쇠 :
정화의 RGCs :
- 정화 RGCs (또는 다른 dissociated 문화) 고정하기 전에 37으로 설정 물을 욕조에 미리 따뜻한 4% PFA 확실하게 ° C ~ 20~25분이 (4 스토어 ° C 다른 모든 시간, PFA의 dilutions를 사용하지 않습니다에 대한 칠일보다 오래된).
- 특히 교양 뉴런에, 그것이 모든 세척하는 동안 진공 흡인기를 사용하지 않는 것이 좋습니다 것은 단계를 씻어. 이러한 파스퇴르 피펫과 흡입 전구를 사용하여 같은 Gentler 방법은 눈에 띄게하여 얼룩의 품질을 향상시킬 수 있습니다.
- 당신의 세포가 헹굼 단계 동안 밖으로 건조하게하면 안됩니다.
- 귀하의 coverslip에있는 세포의 전단을 초래할 수 있습니다 이끌어 또는 이렇게 같은 매니큐어의 응용 동안 coverslips를 이동하지 마십시오.
- 부정 얼룩에 영향을 것입니다 어떤 시켰던 항체를 제거하기 위해 모든 기본 및 보조 항체를 스핀 다운.
- 여러 종의 제기 예약 및 postsynaptic 마커에 대한 기본 항체를 선택하셔야합니다. 이렇게하지 않으면 이차 항체의 응용 프로그램이 후 두 신호 사이의 차별 능력을 제거합니다.
브레인 섹션 :
- 같은 PFA로 fixatives와 쥐 perfuse하지 마십시오.
- 뇌 부분에 대한 차단 솔루션의 트리톤 - X 100에 포함되지 않습니다. presynaptic 마커, 시냅스 vesicles과 관련된 특히 presynaptic 마커에 대한 손해 때문에 얼룩의 품질을하고 있어요.
- 이미지에 대한 공촛점 현미경의 사용은 버렸네 분석을 수행하기 위해 충분한 품질입니다 이미지 수집이 필요합니다.
대표 결과 :
위에서 설명한 버렸네 분석은 체외에서 생체내에서 시냅스 연결의 변화를 캡처하도록 설계되었습니다. 우리가 실험실에서, 우리는 버렸네 형성에 중 개별 또는 여러 astrocyte - 분비 분자의 효과를 결정하기 위해 버렸네 분석을 활용한다. 우리는 일반적으로 정화 RGCs이 버렸네 분석을 수행하는 것을 체외에서 우리는 문화.
RGC 문화를 정화에 astrocyte - 냉방 미디어의 만성적인 응용 프로그램 (ACM)의 잘 설명하는 효과가 RGCs 3,4,5,6 사이에 형성되는 시냅스의 숫자에 여러 배 증가합니다. 그림 1A와 1B는 기저 성장 매체 중 하나 또는 ACM 취급 untransfected 정화 RGCs의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 흥분성의 - 사전과 postsynaptic 마커, S에서 ACM - 유도 증가 염색법 후ynapse 형성 (그림 1A, 1B) 질적 분명하다. 사실,이 찾는는 ACM에서 비롯된 시냅스는 시냅스가 3,4,6 ultrastructurally 정상이라는 것을 보여주기 위해 기능과 전자 현미경 것을 보여주 전기 생리학을 사용한 여러 연구에 의해 뒷받침되었다. 저희 연구실의 다른 작품은 칼슘 채널 subunit 강력 synaptogenic astrocyte - 분비 분자, thrombospondin 3의 연결 수용체로 α2δ - 1을 확인했습니다. 여기 α2δ - 1의 증가 수준 추가 ACM - 유도 버렸네 형성 (그림 3)을 향상 여부를 결정하기 위해 수행되었다 RGCs를 정화에 실험의 결과를 포함합니다.
RGCs는 빈 벡터 중 하나 또는 체외 (DIV5) 5 일 후에 tdTomato 인코딩 별도의 구조와 구성 인코딩 α2δ - 1 cotransfected되었습니다. ACM 또는 GM 중 하나와 함께 만성 치료 후, RGCs는 고정되었으며 DIV 11 스테인드. 우리가 어느 빈 벡터 (pcDNA3.1) 또는 α2δ - 1 (그림 1C, 1D)를 표현 RGCs를 정화에 버렸네 번호 질적 명백한 증가를 볼 흥분성의 시냅스 사전 및 postsynaptic 마커 다음 immunolabeling. 우리는 각각의 조건에서 최소한 15 뉴런에 버렸네 번호 (그림 2)를 계산하기 위해 Puncta 분석기를 사용하여 ACM의 synaptogenic 효과를 계량. 이 정도 크기의 샘플은 우리가 신경 세포 당 시냅스의 평균 개수를 계산하고 빈 벡터 (그림 3, 회색 바)를 표현 아르 ACM - 대우 뉴런에 의해 형성된 시냅스에서 통계적으로 의미 ~ 10 배 증가를 찾을 수 있습니다. 또한, 우리는 ACM에서 비롯된 버렸네 형성 (~ 20 배. 그림 3, 블랙 바)의 중요한 potentiation에 α2δ - 1 단서의 overexpression을 보여줍니다.
교양 뉴런 이외에도, 우리는이 기술을 사용하여 서로 다른 뇌 영역에서 시냅스 밀도를 계량하실 수 있습니다. 우수한 colliculus은 망막 7, 8, 9에 RGCs에서 발생, retinocollicular의 계획을받는 뇌 구조입니다. 출생 후의 발전으로, 우수한 colliculus 그들의 목표에 RGCs에 의해 형성 흥분성의 시냅스의 숫자가 크게 P7에서 P21 7, 8, 9로 증가합니다.
우리 부량 기술을 사용하여, 우리는 retinocollicular의 시냅스의 숫자가 P14로 P7에서 우수한 colliculus 증가에 형성된 것으로 나타났습니다. 이렇게하려면, 우리는 P14에서 다시 P7에서 시냅스 밀도를 계량합니다. 우리는 PSD - 95 (postsynaptic) 및 VGlut2 (우수한 colliculus에 RGC 시냅스 특정 presynaptic 마커)의 우수한 colliculus을 얼룩. 우수한 colliculus의 바깥쪽 시냅스 지역 몇 군데되었다 (그림 4A)과 공동으로 지역화된 VGlut2/PSD-95 시냅스는 동물마다 적어도 3 섹션에서와 시점 당 최소 3 동물에서 (그림 4B, 4C) 계량했다. 결과 데이터의 양을 정함 분명 P7과 P14 사이의 시냅스의 수가 3 배 이상의 상당한 증가를 보여줍니다. 이러한 결과는 전자 현미경 (그림 4D) 9을 이용하여 이전에 게시된 결과와 계약에 있습니다.
결론적으로, 우리가 여기서 설명 버렸네 번호 부량의 방법은 우리가 체외 또는 생체내에서 버렸네 형성을 조작의 효과를 연구함으로써 문화와 신경 조직의 버렸네 번호와 밀도를 결정하는 유용한 도구입니다.
그림 1 : RGCs 투석을 대표하는 시냅스 염색법. (A와 B) 체외 (DIV) RGCs 3 일간의 중 교양되었습니다 (A) 기저 성장 미디어 (GM) 또는 (B) 추가 6 일간 프로 synaptogenic 마우스 astrocyte 에어컨 미디어 (ACM). 세포는 다음 바순 (presynaptic, 빨강)과 홈런 (postsynaptic, 녹색)를 표시했다. 마우스 ACM 강력하게 공동화된 바순과 호머 puncta의 숫자의 증가에 의해 결정으로 RGCs 사이의 버렸네 형성을 자극. (C 및 D) 5DIV의 RGCs은 칼슘 채널 subunit α2δ - 1을 overexpress 수있는 플라스미드와 transfected되었습니다. Transfected 세포는 tdTomato 셀 채우기 (파란색)과 함께 발견되었으며 presynaptic 마커 synapsin 및 postsynaptic 마커 홈런에 대한 스테인드되었습니다. 화살표는 시냅스를 나타냅니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다.
그림 2 :. Puncta 분석기 여기에 표시를 사용하여 버렸네 번호 부량는 (A) 정화 망막 신경절 세포 overexpressing thrombospondin 수용체 α2δ - 1의 원본 이미지가 presynaptic 마커 synapsin 및 postsynaptic 마커 홈런에 대한 스테인드입니다의 예입니다. Puncta 분석기에서 puncta을 분석하면 각 채널에서 만든 마스크에 해당하는 (B) 이미지. (C) Puncta Analzyer 같은 puncta가 작은 검은 점 (삽입된 페이지)으로 표시되는 여기에 표시된 것과 같이 이미지를 생성합니다. 또한 우wn 몇 가지 다른 매개 변수와 함께 puncta 번호가 텍스트 / 숫자 형태 (강조 추가 굵은 텍스트)에서 제공하는 응용 프로그램의 (D) 숫자 출력됩니다.
그림 3 :. 버렸네 분석을위한 대표 결과가 여기에 표시가 비어 벡터 (pcDNA3.1, 회색 바) 또는 thrombospondin 수용체 α2δ - 1 중 하나를 표현 transfected RGCs에 astrocyte - 냉방 미디어 (ACM)와 RGCs의 만성 치료의 synaptogenic 효과입니다 . 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. GM = 성장 미디어. ACM = (쥐) Astrocyte Contitioned 미디어.
그림 4 :. 마우스 우수한 colliculus에서 시냅스 밀도 부량이 (가) 쥐 두뇌에 뛰어난 collicular 대상에 RGCs에 의해 설립된 glutamatergic 시냅스의 숫자의 발달 변화를 확인하려면, 우리는 presynaptic에 대한 항체와 마우스 머리에서 cryosections를 더럽 혔다 마커 VGlut2 (녹색)와 postsynaptic 마커, PSD - 95 (빨간색). 우리는 공촛점 현미경 스캐닝 레이저를 사용하여 RGCs에 대한 시냅스 대상 지역에 해당하는 마우스 우수한 colliculus (SC)의 외부 150 X 150 μm의 영역을 몇 군데. 각 SC 섹션 Z - 스택은 5 μm의 (15 X 0.33 μm의 광학 부분)의 총 깊이에 대한 수집했습니다. 최대 이미지 계획 (MIPS)는 5 MIPS / 섹션을 항복 연속 3 광학 섹션 그룹에 대한 생성되었습니다 깊이 1 μm의를 나타내는 각. 아래와 같이하면 P14 WT 마우스의 우수한 colliculus에서 가져온 대표 MIP입니다. presynaptic 마커, VGlut2은 녹색으로 표시되고 postsynaptic 마커, PSD - 95은 빨간색으로 표시됩니다. (C) 수치 출력 Puncta 분석기에 의해 만들어진. 시점 당 3 동물 (오차 막대는 SEM을 대표)과 동물마다 적어도 3 섹션에 대한 버렸네 번호의 분석 (D) 부량. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
위에서 설명한 버렸네 분석은 하나의 문화를 정화 또는 뇌 섹션에서, 우리는 RGCs의 흥분성의 예측에 주로 초점을했었습니다 우리의 실험 목표의 컨텍스트를 기반으로합니다. 우리는 흥분성의 시냅스 (표 1) 라벨을 위해 잘 작동 참조 테이블 목록 항체를 제공하고 있습니다.
이 버렸네 분석은 버렸네의 모든 인구의 연결 번호 또는 선택 사전 및 postsynaptic 마커가있는 다른 신경 subtype를 정할 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 버렸네 분석이 여기에 설명된는 적절한 사전 및 postsynaptic 마커 10,11를 사용하여 (같은 glutamatergic 반대) GABA - ergic 시냅스를 공부하고 적용할 수 있습니다.
이 버렸네 분석은 뉴런 사이의 시냅스 연결에 변화를 조사하는 실험실을위한 중요한 도구입니다. 그것이 전자 현미경 및 전기 생리학이 분석의 결과를 확증하기 위해 필요한 있지만, 그것은 그럼에도 불구하고 시냅스를 형성 뉴런 '능력을 조절 분자 신호에 대한 중요한 질문에 대답하기 비교적 쉬운 방법을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
Puncta 분석기 플러그인 J는 배리 워크 (현재 주소 : Physion 컨설팅)에 의해 작성되었습니다 이미지를위한 벤 A. Barres의 연구실에서 (스탠포드 대학).
기금;
- 알프레드 P. 슬로언 재단
- 에스더 A. 요셉 Klingenstein 펀드, 주식 회사
- 광범위한 바이오 메디컬 연구 재단
- 헌팅턴의 질병 이니셔티브에 대한 치료
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) | Mouse | Monoclonal |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems |
| Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lysine | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-well culture plate | Falcon BD | 35-3047 | |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | --- | |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR international | 48393241 | |
| Glass slides | VWR international | 48311-703 | |
References
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
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- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
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