이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 과학의 가장 중요한 목표 중 하나는 버렸네 형성의 초기 단계를 지시 분자 신호를 이해하는 것입니다. 따라서 그것은 시냅스 연결에 변화를 수치 객관적 방법을 개발하기 위해 필수적이되었습니다. 샘플 고정부터,이 프로토콜의 세부 내용은 방법 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 수치. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다. 이 colocalizations의 수는 ImageJ 분석 소프트웨어 플랫폼에 따라 Puncta 분석기 (요청시 가능합니다 바리 워크, c.eroglu @ cellbio.duke.edu 작성한)에 플러그를 사용하여 계량입니다. 이 프로토콜에 설명되어 버렸네 분석은 선택적 사전 및 postsynaptic 마커를 가지고있는 신경 조직이나 문화를 준비 적용할 수 있습니다. 이 버렸네 분석이 널리 시냅스 개발 연구에 활용할 수있는 귀중한 도구입니다.
프로토콜
준비하는 솔루션 :
- 항체 버퍼 :
- 150 MM NaCl
- 50 MM - 트리스베이스 (피셔, 고양이 번호 :. BP152 - 5, 50 ㎜) - 1.21 g
- 1퍼센트 BSA (시그마, 고양이 번호 :. A2153, 1 %) - 2.0 g
- 100 MM L - 라이신 (시그마, 고양이 번호 :. L - 1137, 100 ㎜) - 3.65 g
- 7.4으로 산도를 조정
- 0.04 %의 Azide
- 소주 H 2 O. 200 ML에 볼륨을 조정
- 0.22μm 필터를 통해 필터 (Millipore, 고양이 번호 :. SCGPU02RE).
- PFA Diluant :
- 168 ML 0.5 M 나 2 HPO 4 (이염)
- 72 ML 0.5M 나 2 HPO 4 (일염기의)
- 660 ML 증류수 H 2 O
- 교양 뉴런 (솔루션 # 2) 4퍼센트 PFA의 정착액 :
- 10 ML 16% PFA 솔루션 (....
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토론
위에서 설명한 버렸네 분석은 하나의 문화를 정화 또는 뇌 섹션에서, 우리는 RGCs의 흥분성의 예측에 주로 초점을했었습니다 우리의 실험 목표의 컨텍스트를 기반으로합니다. 우리는 흥분성의 시냅스 (표 1) 라벨을 위해 잘 작동 참조 테이블 목록 항체를 제공하고 있습니다.
이 버렸네 분석은 버렸네의 모든 인구의 연결 번호 또는 선택 사전 및 postsynaptic 마커가있는 다른 신경 subtype를 정할 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 버렸네 분석이 여기에 설명된는 적절한 사전 및 postsynaptic 마커 10,11를 사용하여 (같은 glutamatergic 반대) GABA - ergic 시냅스를 공부하고 적용할 수 있습니다.
이 버렸네 분석은 뉴런 사이의 시냅스 연결에 변화를 조사하는 실험실을위한 중요한 도구입니다. 그것이 전자 현미경 및 전기 생리학이 분석의 결과를 확증하기 위해 필요한 있지만, 그.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
Puncta 분석기 플러그인 J는 배리 워크 (현재 주소 : Physion 컨설팅)에 의해 작성되었습니다 이미지를위한 벤 A. Barres의 연구실에서 (스탠포드 대학).
기금;
- 알프레드 P. 슬로언 재단
- 에스더 A. 요셉 Klingenstein 펀드, 주식 회사
- 광범위한 바이오 메디컬 연구 재단
- 헌팅턴의 질병 이니셔티브에 대한 치료
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 항원 | 종 | Polyclonal / 단클론 | 공급 업체 | 카탈로그 번호 | 노동 희석 | 문화 웍스 | 섹션 웍스 | |
| Presynaptic | Synapsin | 토끼 | Polyclonal | 시냅스 시스템 | 106004 | 1:750 | Y | ND |
| Synapsin | 마우스 | 단클론 | 시냅스 시스템 | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| 바순 | 마우스 | 단클론 | 분석 설계 | VAM - PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| 바순 | 기니피그 | Polyclonal | 시냅스 시스템 | 141004 | 1:1000 | Y | ND | |
| Synaptotagmin 1 | 토끼 | Polyclonal | 시냅스 시스템 | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | 마우스 | 단클론 | 시냅스 시스템 | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Synaptophysin (C1.7.2) | 마우스 | 단클론 | 시냅스 시스템 | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | 마우스 | 단클론 | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | 기니피그 | Polyclonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | 기니피그 | Polyclonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Postsynaptic | PSD - 95 (6G6 - 1C9 클론) | 마우스 | 단클론 | 친화 바이오 시약 | MA1 - 045 | 1:750 | Y | N |
| PSD - 95 | 토끼 | Polyclonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| 호머 | 마우스 | 단클론 | 시냅스 시스템 | 160011 | 1:500 | Y | ND | |
| 호머 | 쥐 | Polyclonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | 토끼 | Polyclonal | 시냅스 시스템 | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | 마우스 | 단클론 | 시냅스 시스템 | 147 | 1:200 | Y | Y |
표 1 : 우리가 성공적으로 버렸네 분석에 이용한다는 좋은 사전과 postsynaptic 마커 목록 예제. 이 사용할 수있는 모든 마커의 완전한 목록을지지 않습니다. Y = 예, N = 아니오, ND = 결정되지 않습니다.
| 시약 | 회사 | 고양이. 번호 |
|---|---|---|
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| 폴리 - D - 라이신 | 시그마 | P6407 |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 |
| 트리톤 X - 100 | 로체 진단 GMBH | 9002-93-1 |
| 정상 염소 혈청 | Gibco | 16,210 |
| DAPI로 VectaShield | 벡터 연구소 | H - 1200 |
| OCT | 조직 테크 | 4583 |
| 트리스 -베이스 (50 ㎜) | 어부 | BP152 - 5 |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A2153 |
| 리터 - 라이신 | 시그마 | L - 1137 |
| 16% PFA 솔루션 | 전자 현미경 과학 | 15,711 |
| 입상 PFA | 전자 현미경 과학 | 19,210 |
| 24 잘 문화 플레이트 | 매 | 35-3047 |
| 염소 항 마우스 알렉사 복합 항체 | Invitrogen | --- |
| 공급 | 회사 | 고양이. 번호 |
| 12mm, 번호 0 유리 coverslips | 칼 헥트 GMBH | 1,105,209 |
| 번호 1.5 유리 coverslip (조각)을 | VWR 과학 | 48393241 |
| 유리 슬라이드 | VWR 과학 | 48311-703 |
참고문헌
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A.
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