Summary
Den 3-dimensionella strukturen av en molekyl ger en unik förståelse för hur molekylen fungerar. Den huvudsakliga metoden för strukturbestämning på nästan atomär upplösning är röntgenkristallografi. Här visar vi de nuvarande metoderna för att erhålla tredimensionella kristallerna av en viss makromolekyl som är lämpliga för strukturbestämning av röntgenkristallografi.
Abstract
Med hjälp av tredimensionella strukturen av biologiska makromolekyler att dra slutsatser om hur de fungerar är en av de viktigaste områdena av den moderna biologin. Tillgången på atomär upplösning strukturer ger en djup och unik förståelse av proteiners funktion och hjälper till att reda ut det inre arbetet i den levande cellen. Hittills 86% av Protein Data Bank (rcsb-PDB) poster är makromolekulära strukturer som har fastställts med hjälp av röntgenkristallografi.
För att få kristaller som lämpar sig för kristallografiska studier, makromolekyl den (t.ex. protein, nukleinsyra, protein-protein komplex eller protein-nukleinsyra komplex) måste renas till homogenitet, eller så nära som möjligt homogenitet. Homogeniteten av preparatet är en viktig faktor för att erhålla kristaller som DIFFRAKTERAS till hög upplösning (Bergfors, 1999, McPherson, 1999).
Kristallisering kräver föra makromolekyl till övermättnad. Provet bör därför koncentreras till den högsta möjliga koncentration utan att orsaka aggregering eller utfällning av makromolekyl (vanligen 20-50 mg / ml). Introduktion provet utfällningsmedel kan främja kärnbildning av protein kristaller i lösningen, vilket kan resultera i stora tredimensionella kristallerna växa från lösningen. Det finns två huvudsakliga tekniker för att få kristaller: ångdiffusion och batch kristallisering. I ångdiffusion, en droppe innehåller en blandning av fällningsmedel och protein lösningar är förseglat i en kammare med ren fällningsmedel. Vattenånga diffunderar sedan ut ur droppe tills osmolaritet droppen och fällningsmedel är lika (Figur 1A). Den uttorkning av minskningen orsakar en långsam koncentration av både protein och fällningsmedel tills jämvikt uppnås, helst i kristallen kärnbildning zon av fasdiagram. Partiet metod förlitar sig på att få proteinet direkt i kärnbildning zonen genom att blanda protein med lämplig mängd fällningsmedel (Figur 1B). Denna metod utförs vanligtvis under en paraffin / mineralolja blandningen för att förhindra spridningen av vatten ur nedgången.
Här visar vi två typer av experimentuppställning för ångdiffusion, droppe och sitter droppe, förutom parti kristallisation i olja.
Protocol
Material:
- Protein prov - Lysozym (50 mg / ml)
- Droppe 24-såväl fack
- Sitter drop 24-såväl fack
- Microbatch kristallisering 96 och fack
- Crystallization lösningar (antingen kommersiellt tillgänglig eller hemlagad)
- Silicon fett
- 5 ml spruta utan Luer-lock
- Silikoniserade täcka diabilder
- Optisk förseglingstejpen
- Fotogen
- 0,1-2 mikroliter mikropipett med låg retention tips
- Pincett
- Professionell våtservetter
1. Hängande / sitta Drop Förfarande:
- För den initiala skärmen man kan använda kommersiellt tillgängliga skärmar som utnyttjar gles matris ofullständigt faktorförsök metod för prövning förhållanden. Den gles matris ofullständiga faktorförsök metod är påverkade av och utvalda från kända kristallisering förutsättningar för makromolekyler (Carter och Carter, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik och Kim, 1991;. Jancarik et al, 1991). Om kristallisering villkoret är redan känt, kan en smal skärm monteras, varierande fällningsmedel koncentration och pH kring den ursprungliga träff. De vanligaste framgångsrika fällningsmedel är polyetylenglykol (PEG), följt av ammoniumsulfat. Tillsammans står dessa två precipitants står för cirka 60% av alla registrerade makromolekylära precipitants används för kristallisering (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003).
- Förbered din kristallisering lösningar. Vanligtvis dessa villkor kombineras från en utfällningsmedel, salt av något slag och en buffert för att ställa in pH. I vissa fall tillsatser kan läggas specifikt för protein av intresse. Alla stamlösning skall filtreras med 0,22 ìm filter. En del av beståndet lösning kan vara mycket trögflytande (50% pinnar, glycerol, PEG-MME, etc).
- Förbered 1,5 ml 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6 M NaCl vardera 0,1 M NaOAc pH 4,0, 4,3, 4,6 och 4,9 (totalt 24 lösningar)
- Tina ditt protein prov och hålla på is. Protein bestånd bör förvaras vid -80 ° C förutsatt att proteinet av intresse är känslig för att frysa / tina cykler (i så fall förvaras vid 4 ° C). Typiska protein koncentrationer i intervallet 5-50 mg / mL, med högre koncentration brukar ge bättre resultat.
- Spin provet 15min/18, 000xg / 4 ° C - vissa proteiner tenderar att delvis aggregerade och fällningen efter ett töväder steg. Dessa aggregat kan främja amorf fällning av resten av proteinmolekyler därför noggrann spinn ner kommer att se har du bara lösliga molekyler i ditt prov. Håll protein på is tills inrätta facket.
- Bestäm proteinkoncentrationen från dess absorbans vid 280 nm med en UV-spektrofotometer. Proteinkoncentrationen kan beräknas från absorbans läsning och proteinets extinktionskoefficienten. Extinktionskoefficienten kan beräknas med ProtParam verktyget på Expasy hemsida: http://ca.expasy.org/tools/protparam.html
- Fyll brunnar i 24-väl hänga / sitta släppa magasin med 500 mikroliter av fällningsmedel lösningen enligt facket inställning systemet (Figur 2B). Skapa en ring silikonfett runt kanten av brunnen. Ringen bör ha en liten lucka för att förhindra ackumulering lufttryck som är väl tillsluten. I sittande droppar, finns det inget behov av fett då är väl förseglade med tejp (Figur 2A).
- Ta en cover bild och rengör den med kondenserad spruta, eller en professionell torka - undvika damm kommer att underlätta tolkningen av kristallisation drop och eliminera föroreningar. För att sitta droppar, är locket bilden inte används. I stället innehåller det väl en hylla där protein och fällningsmedel blandas.
- Sätt lika stora volymer av proteinet provet och reservoar lösning på omslaget bilden. Olika volymer av protein och fällningsmedel kan prövas som en del av optimering. Använda mer protein än fällningsmedel resulterar i en netto koncentration av protein i nedgången efter jämvikt, vilket kan vara önskvärt för utspädda protein prover, och att bromsa kristall kärnbildning och tillväxt. Alla andra icke-flyktigt ämne i tappa lösning kommer också att koncentreras med samma faktor. När pipettering proteinet och lösningar reservoar på locket bilden, vara mycket försiktiga för att undvika att bubblor bildas. Detta inträffar ofta när luft blåses ut ur pipetten.
- Droppe: Fyll på 2 mikroliter av 50 mg / ml lysozym i 0,02 M NaOAc pH 4,9 till mitten av locket bilden och lägga till 2 mikroliter av reservoaren lösningen.
- Sittande droppe: Fyll på 2 mikroliter av 50 mg / ml lysozym lösning på mitten av hyllan och lägga till 2 mikroliter av reservoar lösning.
- Vänd locket försiktigt och lägg den ner på fettet ringen ovanpå brunnen. Tryck försiktigt så att luften kan fly från brunnen genom skåran i fett på prOm lufttrycket byggs upp i brunnen och hålla väl förseglade. Lufttrycket uppbyggd i väl kan höja skyddet bilden, kompromissa med bra tätning. I sammanträdet släpp-metoden, är optiskt klar genomskinlig tejp används för att täcka brunnarna. Därför kommer i denna metod tätning äger rum varje rad / kolumn.
- Gå vidare till nästa väl tills plattan är klar.
- Kontrollera facket vid installation - eliminerar damm och andra föroreningar kan minska falskt positiv identifiering av protein kristaller.
- Använd ett poängsystem blad för att dokumentera experimentet.
- Placera plattan på önskad inkubationstemperatur, oftast mellan 4 ° C och rumstemperatur. 20 ° C är vanligast framgångsrika. Var noga med att hantera facket försiktigt och undvika skakning. Var försiktig när du öppnar och stänger inkubatorn dörren. Vibrationer eller temperaturförändringar under transport eller inkubationstiden kan förhindra kristall tillväxt eller försämra kristall kvalitet. En stötdämpande material (exempelvis skum) kan användas som stoppning i kristallen facken.
- Kolla facket för kristallerna följande dag, och därefter var några dagar, alltid hantering av brickor med omsorg. Dokument eventuella resultat och morfologier droppe i ett fack viss poäng ark. Kristaller tar vanligtvis 2-5 dagar att visas, även om kristaller ibland verkar mycket tidigare (nästan omedelbart) eller senare (upp till flera månader!). När kristallisering villkor har identifierats och tillväxttakten av kristaller är känd, är det bäst att lämna facken orörd tills kristaller har dykt upp och vuxit till minst hälften av sin slutliga storlek. Lämnar facken ostört kan minska antalet av kristall kärnbildning händelser, därför producerar mindre antal större kristaller.
2. Microbatch Förfarande:
- Protein prov och fällningsmedel beredning är som beskrivits ovan.
- Airspray en ny microbatch magasin för att undvika att damm och andra större partiklar.
- I microbatch magasin, fyll paraffinolja upp till 3 mm hög (precis tillräckligt för att täcka brunnar). Ta bort åtkomst av olja.
- Ladda 1 mikroliter av protein-lösning (50 mg / ml lysozym) i oljan förfyllda bra - se till att pipettera lösningen direkt till botten av brunnen (Figur 2A).
- Ladda 1 mikroliter av fällningsmedel lösningen i väl enligt facket inställning systemet (Figur 2B) - se till att släppa sjunker till botten av brunnen och säkringar med proteinet droppen.
- Flytta till nästa väl tills plattan är klar.
- Följ steg 11-14 i den hängande / sitta droppe förfarande.
3. Representativa resultat:
Kristallisering brukar kallas flaskhalsen i röntgenkristallografi. En gles matris ofullständigt faktorförsök skärm av utlösande villkor producerar normalt många olika typer av protein aggregering och nederbörd, bland dem stora enskilda kristaller. Om protein eller fällningsmedel koncentrationerna är för höga kan man se bruna saken med någon distinkt form och storlek (amorfa nederbörd). När lösningen är undersaturated kommer släppa ofta vara helt klart och saknar någon form av nederbörd. Figur 3 visar flera exempel för nederbörd fenomen och kristaller (Dessau et al., 2006). Mer nederbörd fenomen med mer detaljerad tolkning kan hittas på http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html .
Figur 1. Principen av protein kristallisering.
Principen av protein kristallisering. I en ångdiffusion experiment (A) lika stora volymer fällningsmedel och protein finns i drop. Vatten kommer diffusa ut och både fällningsmedel och protein koncentration kommer att fördubblas till dess att jämvikt uppnås mellan droppe och behållaren lösningen. I parti kristallisation (B) fällningsmedel och protein koncentration ändrar inte under experimentet. Punkt A - Protein håller undersaturated inga kristaller kan bildas, led b - Protein kärnbildning ske, började kristaller för att bilda och koncentrationen av protein i lösning sjunker till mättnad. Punkt C - Protein fällningar, men kristaller kan fortfarande växa. (C) Dialys kristallisering med hjälp av en gel-ansluten kapillär. Kristaller visas som salt diffunderar ut av proteinet provet (och / eller fällningsmedel diffunderar in i proteinet prov) över gelen kontakten.
Figur 2. Sammanfattning av typiska experiment protein kristallisering.
(A) Förfaranden för droppe ångdiffusion, sittande droppe ångdiffusion och microbatch protein kristallisering. I varje fall är en liten mängd koncentrerat protein prov blandas med en lika eller mindre volym precipitanT-lösning och får jämvikt. (B) För kristallisation av kyckling lysozym, ett 24-såväl fack bildas med olika koncentrationer av natriumklorid (den fällningsmedel) och med 0,1 M natriumacetat som buffert vid olika pH (4,0-4,9).
Figur 3. Typiska resultat av ett protein kristallisering experiment.
(A) Amorfa nederbörd. När protein eller fällningsmedel (eller båda) är i hög koncentration. (B) fasseparation. Protein eller rengöringsmedel kan den lossna till en annan fas när det blandas med vissa precipitants vid hög koncentration. (C) Rod formad protein kristaller av AtCSN7 erhållits i polyetylenglykol 8000 och magnesium acetat (Dessau et al., 2006). (D) lysozym kristaller erhålls i 1,0 M NaCl och natriumacetat pH 4,9. (E) Enligt mättade droppar brukar vara tydlig. Fotografi av Moshe Dessau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel kommer vi beskriva och visa allmänt gällande protokoll för protein kristallisering. Eftersom det en multi-steg finns det några faktorer man måste vara medveten om. När du arbetar med mycket små volymer (0,5-2 mikroliter), torkning av nedgången på grund av avdunstning är ett stort problem. Därför rekommenderas det att arbeta i en väl kontrollerad miljö (med lågt luftflöde, hög luftfuktighet och täta temperaturkontroll) och anta en teknik som minimerar exponeringen av nedgången i det fria. Av denna anledning är det viktigt att arbeta i en väl organiserad arbetsmiljö. Alla reagenser bör vara beredd innan inrätta facket och lab-utrustning bör ligga inom räckhåll (pipetors, tips, rör, våtservetter, etc).
Som regel, ta ditt protein av lagring så nära som möjligt den tid du kommer att bygga upp facket. På så sätt finns det färre miljöpåverkan på prov. Det är mycket viktigt att hålla det protein röret i nacken i röret och inte på botten där proteinet är, så provet inte kommer att få uppvärmd av din kroppstemperatur. Med ovanstående åtgärder kan den experimentella felmarginalerna minimeras, vilket ökar resultatens reproducerbarhet.
Det finns många möjliga ändringar av de protokoll som beskrivs här. Man kan förändra proteinkoncentration, protein / fällningsmedel förhållandet, temperatur (4 ° C - 37 ° C) kan pH och olika tillsatser läggas till. En annan relativt vanlig metod för protein kristallisering är dialys. I denna metod är det protein lösningen dialyseras mot en fällningsmedel lösning genom ett semipermeabelt membran. Dialys prövningar är mer omständligt att ställa upp, men en fördel med dialys är att utfällningar av låga jonstyrka lätt kan testas. Detta är önskvärt om proteinet är svårlösliga vid låga salt-koncentrationer, eftersom proteinet då kan kristalliseras eftersom salt är dialyseras bort från protein buffert. En fast fas (gel) kan användas för att kontrollera graden av dialys. Till exempel kan en agarosgel i en kapillär användas som diffusion gränssnittet mellan protein och fällningsmedel lösningar (Figur 1C).
Öka koncentrationen av en Utfällningsmedlet till en punkt strax under övermättnad och sedan justera pH eller temperatur att minska lösligheten av proteinet kan användas för att kristallisera prover med låg proteinhalt koncentration. Ändring av pH-värdet kan göras mycket väl med ångdiffusion tekniken, när flyktiga syror och baser, t.ex. ättiksyra, ammoniumhydroxid eller ammoniumacetat används (McPherson, 2004).
I mikro-sats tekniken en hel rad oljeblandningar kan testas för att täcka brunnarna. Olika oljor har olika avdunstning permeabiliteten, och därmed producera olika satser av koncentration förändringar av det protein / fällningsmedel blandning som oljan.
Kristallisering är en förutsättning steg för att göra strukturella studier av makromolekyler på nästan atomär upplösning. De metoder som beskrivs här är alltså grundläggande att studera enzym mekanismer och protein-protein eller protein-nukleinsyror interaktioner, och är i slutändan en av de viktigaste verktygen i struktur-baserade läkemedlet design och utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Burroughs Wellcome Investigator Award till YM och av en Brown-Coxe postdoktorsstipendium från Yale University till MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | |
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | |
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | |
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | |
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | |
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. Crystallization of biological macromolecules. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
