Summary
Den här artikeln beskriver förfaranden för att förbereda hippocampus skivor från råttor och transgena möss för studier av synaptiska förändringar i samband med hjärnans åldrande och åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom.
Abstract
Den gnagare hippocampus skiva förberedelse är kanske den mest välanvända verktyg för att undersöka däggdjur synaptisk funktion och plasticitet. Hippocampus kan utvinnas snabbt och enkelt från råttor och möss och skivor förbli lönsamma i timmar i syresatt konstgjorda ryggmärgsvätska. Dessutom är grundläggande electrophysisologic tekniker lätt appliceras på utredning av synaptiska funktionen i hippocampus skivor och har gett några av de bästa biomarkörer för kognitiva funktionsnedsättningar. Den hippocampus skiva är särskilt populär för att studera synaptisk plasticitet mekanismer involverade i inlärning och minne. Förändringar i induktionen av långsiktiga potentiering och depression (LTP och LTD) i synaptiska effekt i hippocampus skivor (eller brist därav) används ofta för att beskriva neurologiska fenotyp kognitivt nedsatt djur och / eller för att utvärdera verkningsmekanismen för nootropic föreningar. Den här artikeln beskriver de procedurer som vi använder för att förbereda hippocampus skivor från råttor och transgena möss för studier av synaptiska förändringar i samband med hjärnans åldrande och Alzheimers sjukdom (AD) 1-3. Användning av gamla råttor och AD möss modell kan presentera en unik uppsättning utmaningar för forskare vana vid att använda yngre råttor och / eller möss i sin forskning. Åldrad råttor har tjockare skallar och hårdare bindväv än yngre råttor och möss, vilket kan fördröja hjärnans utdrag och / eller dissektion och därmed förneka eller överdriva riktiga åldersrelaterad skillnad i synaptisk funktion och plasticitet. Åldrande och amyloid patologi kan också förvärra hippocampus skador under dissektionen förfarandet, återigen försvårar eventuella slutsatser dras av fysiologiska bedömning. Här diskuterar vi de åtgärder som vidtagits under dissektionen förfarande för att minimera dessa problem. Exempel på synaptiska svar förvärvas i "friska" och "ohälsosamma" skivor från råttor och möss finns, liksom företrädare för synaptisk plasticitet experiment. Den möjliga effekten av andra metodologiska faktorer på synapserna i dessa djurmodeller (t.ex. inspelning lösning komponenter, stimulering parametrar) diskuteras också. Medan fokus i denna artikel är om användningen av äldre råttor och transgena möss, nybörjare att skära fysiologi bör hitta tillräckligt detaljerat här för att komma igång med sina egna studier, med hjälp av olika musmodeller.
Protocol
1. Förbereda Iskallt syresatt Konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF)
- Förbered två L i "Ca 2 +-free" ACSF. I en 2L Erlenmeyerkolv, tillsätt ca 1,5 L i steril eller dubbel-destillerat H 2 O, och börjar under kraftig omrörning på en uppståndelse tallrik. Lägg till följande ACSF komponenter (i mm): 124 NaCl, 2 KCl, 1,25 KH 2 PO 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3, och 10 dextros (se tabell 1). Ta med en volym på 2 L med destillerat H 2 O.
- Använda ett akvarium bubbelflaskan och slang kopplad till en 95% O 2 / 5% CO 2 luft tank, syresätta ACSF kraftigt i ca 20-30 min. Kontrollera pH, och vid behov anpassa sig till 7,4 med NaOH eller HCl.
- Häll 750 ml av syresatt Ca2 +-fri ACSF till en separat Erlenmeyerkolv täcka öppningen med parafilm, och transport till en ultrafreezer (-80 ° C) i 20-30 min. Detta material kommer att användas för dissekering av hjärnan och akut hippocampus skivor *. Tillsätt 2 mM CaCl 2 till de återstående 1,25 L volym ACSF #, rör om ordentligt och återuppta syresättning med 95% O 2 / 5% CO 2. Detta kommer att användas för lagring av hjärnan skivor efter dissektioner, och för perfusing skivor under elektrofysiologiska inspelningar.
* Iskallt Ca 2 + fria medier används för långsam ämnesomsättning och minimera Ca2 +-beroende excitotoxicity under dissektion.
# Förändringar i Ca 2 + dysreglering under åldrandet och AD kan ha en stor inverkan på induktion av Ca2 +-beroende synaptisk plasticitet 4-9. Motstridiga rapporter om åldersskillnader i LTD kan delvis hänföras till användning av olika ACSF Ca 2 +: Mg2 + nyckeltal under slice inspelningar (se 2,4,10). Betydelsen av Ca2 +-förordningen och ACSF Ca 2 + nivå i åldrandet studier behandlas mer utförligt i diskussionsavsnittet. - Medan Ca 2 +-fria ACSF är frysning, förbereda ett innehav kammare för underhåll av hjärnan skivor före och under elektrofysiologiska inspelningar *. Vi använder en anpassad makroekonomisk hålla kammare som innehåller fyra individuella microchambers (se figur 2). Den macrochamber är fylld med sterilt, syresatt H 2 O och microchambers är i huvudsak öar som sticker ovanför vattenytan. Inom varje microchamber, skivor vila på kvittas in i en grund pool av syresatt ACSF. Segment är inte helt under vatten, men sitter på ett gränssnitt med fuktad luft. En isolerad värmeelement inom macrochamber tillåter temperaturinställning.
* Flera varianter av att hålla kammare finns även kommersiellt tillgängliga (t.ex. Warner Instruments lämnar en nedsänkning-stil "Pre avdelningen # BSC-PC) och bör vara lämplig för användning i åldrande och transgen mus studier skiva. I en nypa kan skivor behållas för flera timmar i en liten petriskål fylld med ACSF. Gör ett litet hål i petri lock för en syretillförsel rör. Var försiktig så att syre bubblor inte fysiskt göra agitera skivorna. segment kommer att få tillräckligt med syre om leveransen röret höjs till strax ovanför ACSF ytan (gas-spridning bör leda till en fördjupning i vätskan yta).
2. Brain Borttagning och hippocampus Dissection i Aged (> 20-månader gamla-råtta)
- Förbered * dissekering område intill en stor diskbänk (se figur 1 och tabell 2). Placera ett litet djur giljotin i diskhon och lägg ut kirurgiska instrument och material för hjärnan bortforsling och hippocampus dissektion med en vikt pappershandduk, en # 11 skalpell blad, beebee sax, ben rongeurs, en "Hippocampus verktyg" (en specialiserad dubbel spatel från Fin kirurgiska instrument), små kirurgiska saxar, en tunn tvåsocklad spatel, plast pasteurpipett, 110 mm diameter Whatman Filtrerpapper, ett lock 100 mm glas petriskål fylld med is, och en plastsked. Också hålla en plastpåse i närheten för bortskaffande av kadaver.
* Brain utvinning bör slutföras så snabbt som möjligt, så det är en bra idé att mentalt "gå genom" förfarandet och lägg ditt instrument i ordning för användning. - Ta bort Ca2 +-fri ACSF från frysen. Media bör delvis, inte helt, frysta. Häll ca 50 ml ACSF i ett glas bägare, täck med Parafilm och placera bredvid dissekering området. Detta kommer att användas för att kortfattat lagra hjärnan när den tas bort. Resterande Ca2 +-fria medier kommer att användas för att fylla behållaren i Vibratome för bit beredning. Detta media kan reoxygenated, eller helt enkelt täckt med Parafilm och placeras i kylskåp vid 4 ° C.
- Euthanize råttan med hjälp av metoder som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Våra djur är placerade i en liten plexiglas kammare som successivt fylls med 100% CO 2. Medvetslöshet inträffar vanligen inom fem minuter och bekräftas av frånvaron av reflex aktivitetefter en tå nypa.
- Halshugga råttan genast rostralt att den första halskotan och placera huvudet på den vikta pappershandduk. Använda # 11 skalpell, snabbt göra ett snitt i mitten av hårbotten börjar nära näsben och kör caudally till occipital benet. Var noga med att skära helt igenom kutana muskler, helt utsätta suturer på rygg ytan av skallen.
- Skär genom skalle plattorna med beebee sax. Hos unga råttor och möss, kan skallen snabbt avlägsnas med hjälp av ben rongeurs ensam. Men åldern råttor har tjockare skallar än unga vuxna råttor och möss som kan göra detta förfarande svårt. Vi har funnit att skära genom skallen avsevärt underlättar ben borttagning med rongeurs, minskar skador på hjärnan, och sparar dyrbara sekunder. Med råtta fast huvudet på bänk, placera i framkanten av den lägre rent av beebee saxen i den överlägsna regionen i foramen magnum i den bakre delen av skallen. Att hålla lägre ren stadigt mot skallen inre yta (och bort från hjärnan) *, skär genom skallbenet plattan, och sedan längs mittlinjen sutur av parietala plattorna. Fortsätt rostrally tills du skär genom den främre skallen plattorna.
* Det är ytterst viktigt att trycket riktas bort från hjärnan för att förhindra oavsiktlig mätning. - Separera occipital, parietala och temporala tallrikar skalle från hjärnan. Fortsätt att hålla huvudet stadigt på bänken för stabilitet och dra nytta av och skjut ner käken av rongeurs under vänster parietala plattan upprätthålla trycket mot insidan av skallen. Därefter pressa käftar rongeurs ihop och rulla handleden uppåt och mot dig för att dra i parietala och nacken tallrikar bort från hjärnan. Detta bör utsätta de flesta av de dorsala ytan av vänster hjärnhalva. Om det behövs, använd rongeurs att ta bort den vänstra främre plattan också. Upprepa denna procedur för de andra halvklotet. När plattorna är på flykt, snabbt inspektera för eventuella dura fråga som kan fästas på den temporala tallrikar och sträckte över ytan av hjärnan. Dra försiktigt ut dessa bort med rongeurs eller skära bort med sax *. Nu, skjut överkäken av rongeurs mellan hjärnan och rätt tidsmässiga plattan, återigen hålla trycket mot skallen och bort från hjärnan. Pressa och vrid den timliga plattan bort från hjärnan. Du bör höra / känna en "crunch" som du gör detta. Upprepa på vänster sida.
* Den Dura kan vara svåra att upptäcka, särskilt om djuret transcardially har perfusion med ACSF. Men om dura inte tas bort, kommer de att skära genom hjärnan (och förmodligen hippocampus) som en rakkniv när temporal plattorna tas bort. Snipping duran bort nära tidsmässiga plattorna kommer att minimera risken för stickande hjärnan. - Utdrag hjärnan *. Snabbt bort parafilm från Ca 2 +-fria ACSF "slaskig". Nu skjuter den breda spatel huvudet av hippocampus verktyget mellan ventrala ytan av hjärnan och bottenplåtar skallen tills den är helt under hjärnan. Flytta spatel sidled från sida till sida och sedan framåt och bakåt några gånger för att bryta intakt kranialnerver. Nu scoop hjärnan ut med hippocampus verktyg och dränka i Ca 2 +-fria ACSF och täck med parafilm. Låt hjärnan kylan i ungefär en minut. Detta är ett lämpligt tillfälle att rensa bort giljotinen, avyttra av slaktkroppen, och omorganisera dissektion området.
* För steg 2,3-2,7, är snabbhet det väsentliga. Vi försöker slutföra den här proceduren (från halshuggning till hjärnan nedsänkning i ACSF) i 30-35 sek. Enligt vår erfarenhet extraktioner tar längre tid än en minut tycks påverka hippocampus skiva hälsa, särskilt för äldre råttor. Med hjälp av dessa förfaranden har vi observerade inga skillnader i utvinning gånger mellan gamla och unga råttor för våra studier. - Extrahera hippocampi. Placera Whatman filterpapper på locket till den iskalla petriskål och fukta pappret med ACSF använda plasten överföringspipetten. Hämta hjärnan från ACSF med hjälp av en sked och placera på den fuktade Whatman papper. Med hjälp av skalpell blad, ta bort lillhjärnan och cirka en fjärdedel av rostralt frontalloberna. Kör skalpell blad genom intrahemispheric fissuren att helt separera de två hjärnhalvorna. Placera en halvklotet tillbaka in i ACSF slaskig och "stå" den andra upp på dissekera scenen så att coronal plan frontalloben är riktat nedåt. Du ska tydligt kunna skilja hjärnstammen och mitten av hjärnan (som är vita) från den överliggande cortex (som är rosa / gråaktig). Leta reda på överlägsna och underlägsna colliculi på mellanhjärnan, dessa kommer att se ut två vita "knoppar" och kommer att vara i "toppen" av hjärnan i denna riktning. Med hjälp av kirurgiska saxar, försiktigt tag mellanhjärnan på plats och skjut väger stekspade i gapet varalan colliculi och neocortex. Mycket försiktigt, fortsätter att glida spateln ned och dra hjärnstammen / mitthjärnan / Thalamus bort att avslöja insidan av laterala ventrikeln och den mediala ytan av hippocampus. Använd den vassa eggen av spateln för att smidigt kapa de fornix, en vit fiber bunt ligger vid den främre / dorsala delen av hippocampus. Med sax, försiktigt fortsätta att dra i hjärnstammen / mitthjärnan / thalamus bort utan att helt skära av den från resten av hjärnan. Hjärnbarken med Hippocampus ska nu låg fritt tillbaka från hjärnstammen *. Vrid sedan dissekera skede så att du tittar på den mediala hippocampus och överliggande cortex som om det vore en sagittal avsnitt (minus thalamus). Du bör nu se den vita fimbria fibrer som bildar ett grunt hyperbel längst ner i hippocampus i detta plan. Använda plast överföringspipetten försiktigt spruta lite ACSF i springan under fimbria att hjälpa till att separera hippocampus från cortex. Skjut försiktigt in spateln i denna klyfta, så att den långa sidan av spateln löper parallellt med den långa axeln av hippocampus. När spateln är helt under hippocampus, håll ner hjärnstammen / mitthjärnan / Thalamus ordentligt med saxen och rulla spateln från kroppen för att fysiskt skilja hippocampus från resten av hjärnan. När hippocampus är gratis, försiktigt klippa bort eventuella kvarvarande cortex, blodkärl och vit substans. Scoop en liten mängd ACSF slaskigt på bortre sidan av dissekera scenen. Försiktigt ställning hippocampus intill slask och släck med några milliliter av ACSF använda plasten överföringspipetten. Nästa, ta bort den andra hjärnhalvan och upprepa dissekering.
* Du kan behöva en sax att klippa bort ytterligare bindväv, vita substansen eller kärl som förhindrar separation av hjärnbarken från hjärnstammen. De punkter i din sax kommer att vara mycket nära den hippocampus, så se till att leverera mycket exakta snips (vass sax är ett måste).
3. Brain Borttagning och hippocampus Dissection i Aged transgena möss
- Euthanize och halshugga musen och gör en mittlinje snitt i hårbotten som beskrivs i avsnitt 2.3. Möss har mycket tunnare skallar än råttor som förenklar hjärnan extraktion. Skära genom skallen med en sax är därför onödig. Använd ben rongeurs med mindre backar (tabell 2) att dra bort occipital, parietala och temporala tallrikar skalle. Precis som med råttan, kom ihåg att använda kontrollerade rörelser och bestämt dra i underkäken av rongeurs i den inre ytan av skallen och bort från hjärnan som du tar bort plattorna. När plattorna tas bort, använd den smala änden av hippocampus verktyg för att avskilja kvarvarande kranialnerver och scoop hjärnan i iskalla Ca2 +-fri ACSF.
- Förbered hjärnan skivor. På grund av den mindre storleken av musen hjärnan, dissekera den hippocampi kan vara lite mer utmanande (men säkert genomförbart) än med råttor. Så, för att göra det enklare, tar vi bort lillhjärnan och rostralt tips av frontalloberna, men inte dissekera ut hippocampi. Istället är hjärnhalvorna fysiskt åtskilda med en skalpell blad och vänster intakt för Vibratome sektionering (se avsnitt 4 nedan).
4. § hjärnvävnad i skivor med en vibrerande mikrotom (Vibratome) och Transfer till Holding avdelningen *
- Fyll behållaren i Vibratome med iskalla Ca2 +-fri ACSF, så att skära scenen och blad helt under vatten. För att göra råtta skivor, skär bort rostralt och caudal tips varje hippocampus med en skalpell blad. Dessa nedskärningar kommer du att kunna vertikalt placera hippocampi nära varandra som två kolumner. Detta fungerar bäst om dentate gyrus varje hippocampus står inför varandra och CA3 regioner är orienterade i samma riktning. För att göra musen skivor, vertikalt läge varje halvklotet nära samarbete med frontalloberna nedåt. Limma hjärnvävnad på en Monteringskloss och överföring till sektionering skede av Vibratome. Vi förbereder typiskt ~ 400 UM sektioner för synaptisk fysiologiska experiment. Tunnare bör vara beredd om det fluorescerande imaging kommer att genomföras (t.ex. undersökningar av Ca 2 + nivåer och transienter). Samla skivor med en bred mun pipett eller en pensel # och överför till en liten petriskål med iskall Ca2 +-fri ACSF.
* Användning av en Vibratome minimerar skador på övre och nedre ytorna på slice och är definitivt rekommenderas för studier som kräver analys av celler nära slice yta (t.ex. spänning klämma och Ca 2 + imaging studier). Men billigare alternativ är tillgängliga och lämpliga för att generera skivor för extracellulärt fysiologiska experiment. Vi har använt en liten gravitation kontrollerad chopper 2,11 och en McIlwain Tissue Chopper 12 med god framgång. För this förfarande hippocampi placeras på en iscensatt och snittades med en vertikal chopper. En borste används för att överföra skivor (en i taget) till en liten hålla fat fyllt med iskallt Ca2 +-fri ACSF. Ett problem med detta tillvägagångssätt är att hippocampi kan flytta mellan kotletter resulterar i ojämna sektioner. Var också noga med att ta bort så mycket vit materia, och speciellt så mycket kärlsystemet, som möjligt innan hackning. Detta material fastnar på borsten, rakbladet, eller båda, vilket gör skiva överföra mycket svårt och öka sannolikheten för stretching eller skador på vävnaden.
# När du använder en pensel, försök att vila skiva på längden över borsten. Inslagning segmentet runt penselspets kan orsaka onödig vävnad stretching. - Överföring hjärnan skivor till anläggningen kammare där de badar i syresatta Ca 2 +-innehållande ACSF. Successivt anpassa kammaren temperaturen från 27 ° till 32 ° C (+1 ° var femte minut). Låt skivor att inkubera 1-1,5 h innan elektrofysiologiska experiment.
5. Framkalla och Spela CA3-CA1 Synaptic Svar
- För grundläggande extracellulära inspelningar i akut skivor kommer din elektrofysiologi station måste innehålla *: en inspelning kammare, en genomblödning systemet, ett mikroskop med> 4x förstoring förmåga, registrering, stimulerande och mark elektroder, makro och micromanipulators, en styv vibrationsbeständig bordsskiva och Faradays bur, en stimulator, förstärkare och analog-till-digital (A / D) omvandlare, oscilloskop (helst), och personliga PC med lämpliga förvärv mjukvara.
* Kerr vetenskapliga instrument erbjuder en fantastisk och billig elektrofysiologiska system (dvs. de Kerr Tissue Recording System) för att genomföra en rad grundläggande experiment skiva elektrofysiologi. Detta system har en liten plats, bärbara stimulatorer och förstärkare, och kan användas på en vanlig labb-bänken utan behov av en skrymmande Faradays bur.
Naturligtvis kan hjärnan skivor även användas för att utföra många utarbeta elektrofysiologisk och avbildningstekniker, vilket kommer att kräva ytterligare utrustning och material. Till exempel innehåller våra viktigaste elektrofysiologi station en förstärkare med snabba spännings-och ström-clamp kapacitet, en fluorescerande belysning system, och en digitalkamera. Denna station används för extracellulära fältinspelningar i hjärnan skivor samt patch-clamp inspelningar och fluorescerande avbildning i skivor och cellkulturer 3,12,13. Se tabell 3 för en fullständig lista av utrustning och komponenter. - Med hjälp av en bred mun pipett eller liten pensel, överföra en eller flera skivor på inspelningen kammaren * gör det möjligt att acklimatisera sig i 10-15 minuter före stimulering / inspelning. För våra studier, skivor nedsänkt i ACSF och vila på nät in i en RC-22 kammare av Warner instrument (se figur 3). ACSF är tyngdkraften genom en regulator för att justera flödet och uppvärmd till 32 ° C genom ett inline mikro-värmare innan inspelningen kammaren. En centraldammsugare linje används för att avlägsna ASCF.
* Många olika varianter av dränkbara och gränssnitt stil kamrarna inspelning finns kommersiellt tillgängliga. Vi har konstaterat att skivor uppvisar mer robust synaptiska svar i ett gränssnitt kammare (dvs skiva sitter vid ett gränssnitt med fuktad luft och ACSF) 2,11. Dock är responsivitet generellt mer stabil när skivor är nedsänkta i ACSF. Drug perfusionen är också mer effektiv i nedsänkning kammare. - Position stimulerande och inspelning elektroder. Med stimulatorn eller påverkan isolator påslagen, men produktionen ringt ner till 0, placera en stimulerande elektrod över segmentet i stratum radiatum regionen CA2 nära CA3 gränsen (se diagram 4). Vi använder en tvinnad tråd platina iridium att leverera 50-100 uS diphasic pulser till CA3 Schaffer säkerheter (SC) fibrer. Användningen av platina iridium tråd och diphasic pulser kan minimeras elektrod polarisering. Lägre en inspelning elektroden i CA1 stratum radiatum, bara bryta ytan på skiva. Vår inspelning elektrod är en Ag / AgCl-kabeln i en ACSF fyllda glas mikropipett (tips motstånd ~ 7 Mohm). Vrid utgången på stimulator upp till en måttlig nivå (vi sätter våra stimulans isolator till ~ 150 μA) och börja administrera stimulans pulser och förvärva verksamheten med hjälp av förvärv programvara, till exempel Clampex från Axon Instruments, Inc. långsamt sänka stimulerande elektrod i små intervall tills en stimulans artificact spelas in i CA1. Därefter fortsätta att sakta sänka både stimulerande och inspelning elektroder i intervaller medan förvärva CA1 svar tills fibern volley (FV) och den excitatoriska postsynaptiska potentialen (EPSP) amplituder når maximal nivå (se Figur 4B).
- Upprätta en synaptisk styrka kurva och undersöka synaptisk plasticitet. För att generera en synaptisk styrka kurva, ge stimulans pulser till SC på allt högre stödnivåer och spela in the motsvarande aktivitet i CA1. Utbudet och antalet stimulans används intensitet kan variera men bör vara tillräcklig för att generera en sigmoidal kurvan när plottas mot antingen FV eller EPSP värden (Figur 5). I FV amplitud ger en tillförlitlig uppskattning av andelen presynaptiska aktiverade fibrer, medan EPSP sluttningen ger en frisk mått på monosynaptic CA3-CA1 strömmar. Plotta EPSP sluttningen mot FV olika nivåer stimulusintensitet därför återspeglar storleken på EPSP per antalet aktiverade afferenter och ger en utmärkt skattning av CA3-CA1 synaptisk styrka. Normalt är synaptiska styrkan nivåer betydligt minskat i området CA1 av gamla råttor och APP/PS1 möss, i förhållande till unga råttor och åldersmatchade vildtyp möss se t.ex. 4,14.
- Skivor som visar tecken på dålig hälsa (dvs en maximal EPSP amplitud <1 mV) eller hyperexcitabilitet (dvs. uppkomsten av två eller fler invånare spikar) under det synaptiska styrkan kurvan är undantagna från den statistiska analysen (se Figur 4C). Vi har funnit att dessa skivor sällan uppvisar stabil svar över en 60 min period och / eller uppvisar ett starkt varierande reaktioner efter induktion av synaptisk plasticitet. Det förtjänar att notera är att "ohälsosamma skivor" utgör endast ca 10-20% av alla skivor som överförs till inspelningen kammaren. Dessutom är enligt vår erfarenhet är frekvensen av att identifiera en ohälsosam bit väldigt lika oavsett ålder, art och genotyp.
- Förmå långsiktig potentiering (LTP) eller långsiktiga depression (LTD) i skivor. LTP och LTD är varaktiga ökningar (LTP) och minskar (LTD) av synapserna som svar på olika mönster av synaptisk aktivering. Båda processerna är allmänt anses spegla kritiska mekanismer för inlärning och memory15 och ge användbara resultat åtgärder för att undersöka cellulära mekanismer av neurala dysfunktion och / eller för att bedöma farmakologiska strategier för att lindra minne underskott och neurodegeneration 16.
För synaptisk plasticitet experiment, återställa stimulusintensitet för alla skivor till 1 mV * och börjar baslinjen stimulans på frekvensen 0,033 Hz. EPSP lutning värden bör vara stabil i minst 20 minuter före induktion av LTP eller LTD. Noga övervaka EPSPS under denna tid och återställa stimulusintensitet om lutningen varierar mer än 10% och starta en ny baslinje. Inducerar LTP med en en andra tåget på 100 Hz stimulering eller flera korta stötar (~ 10 pulser) på 100 Hz stimulering ges varje 200 ms. För LTD induktion, levererar 900 stimulus pulser med en hastighet av 1 Hz. Efter induktion av LTP eller LTD, samla synaptiska svar för ytterligare 60 min eller mer. EPSP lutning värden som erhållits före och 60 min efter hög / låg frekvens stimulering jämförs för att fastställa förekomsten av LTP eller LTD.
Åldrad råttor och APP/PS1 möss tenderar att visa bristfällig LTP och förbättrade LTD (se figur 5), och dessa förändringar har föreslagits bidra till nedsatt kognition i dessa djurmodeller 6,16. Men till skillnad från APP/PS1 möss, förändringar i LTP / LTD i åldern råttor är rörliga över hela labben. Åldrad råttor uppvisar generellt likartade LTP nivåer jämfört med vuxna som svar på "intensiv" (dvs 100 Hz) stimulans, men visar underskott när mildare stimulering parametrar används (dvs lägre stimulans frekvenser eller färre pulser stimulus) (för granskning se 4,6, 16). Dessutom har vissa laboratorier, inklusive vår, konstaterade ökad mottaglighet för LTD induktion i åldern råttor 2,17-19, medan andra grupper har funnit någon skillnad eller nedsatt känslighet i deras äldre djur. Som diskuteras kortfattat nedan (se diskussion) kan subtila men viktiga skillnader i försöksprotokoll hänsyn till dessa skillnader.
* Den stimulering intensitet och EPSP amplitud kan påverka LTP induktion och kan vara en viktig orsak till avvikande resultat i litteraturen. Detta kommer att behandlas vidare i diskussionsavsnittet.
6. Representativa resultat
Vårt arbete, och arbete från andra grupper, tyder på att förändringar i astrocyternas-baserade inflammatorisk signalering kan utlösa och / eller påskynda neurologiska störningar under åldrandet och AD 13,20,21. Nyligen har vi använt synaptisk styrka, LTP och LTD som endpoint åtgärder för att utreda effekten och verkningsmekanismerna för flera nya anti-inflammatoriska reagenser i mitten åldern APP/PS1 möss (se 22 för beskrivning av denna modell) och åldern Fischer 344 råttor. Resultaten nedan erhölls via de protokoll som beskrivs i artikeln.
En av de nya anti-inflammatoriska Adeno-associerad viral (AAV) reagens som utvecklats av vårt labb har visats i pilotstudier i syfte att avsevärt öka synaptiska styrkan (p <0,05) och förhindra LTP underskott (p <0,05) i mitten av år (16 månader gamla) APP/PS1 möss (n = 4-6 skivor per behandling tillstånd). Representant synaptisk styrka kurvor och LTP experiment från två olika skivor, samlsad från samma 16-månader gamla APP/PS1 musen, visas i figur 5A-C. En skiva pressats ur halvklotet som behandlats med vår nya AAV (Reagens A), medan den andra slice behandlades med en kontroll AAV reagens (Control). LTP förmåddes i både skivor med två 1 sek tåg med 100 Hz stimulering (10 sek intertrain intervall). Observera att den synaptiska styrkan kurvan för Reagens A-behandlade slice förskjuts till vänster om kontrollen skiva, ett tecken på ökad synaptisk styrka. Observera också att, typisk för mitten av år APP/PS1 möss, skämda LTP snabbt till utgångsvärdet i kontrollen slice (t.ex. 23). Omvänt förföll LTP lite i segmentet som behandlas med vår nya reagens.
I en andra ny studie noterade vi betydande LTD i fordon behandlas medelålders råttor (85% av före LTD baslinjen, p <0,05). Däremot fanns ingen LTD observeras hos åldrade råttor som behandlats med nya anti-inflammatoriska "Drug A" (97% av pre-LTD baslinjen, ej signifikant). Inga droger effekter på synaptisk styrka observerades. Representant LTD experiment från denna datamängd (n = 8-10 råttor per grupp) illustreras i figur 5D-F.
Figur 1. Verktyg och material som används för hjärnan dissekering. A, pappershandduk. B, skalpell blad. C, Beebee sax. D, ben rongeurs (för råttor). E, ben rongeurs (för möss / råttor). F, plastsked. G, plast överföringspipett. H, hippocampus verktyg. Jag, spatel. J, kirurgisk sax. K, glas petriskål.
Figur 2. Anpassad hjärnan skiva håller kammare. A, macrochamber. B, lock. C, H 2 O reservoar med perforerad silikonslang. D, microchamber. E, ACSF leverans rör (polyeten). F, O 2 leverans röret. G, port för temperaturkontroll. H, nettas microchamber infoga.
Figur 3. RC22 nedsänkning kammare. A, inspelning kammare. B, Ground elektrod. C, aspiration nål.
Figur 4. Hippocampus skiva illustration och extracellulära vågformer. A, Cartoon ett tvärgående hippocampus avsnitt används i elektrofysiologi experiment. CA = Cornu Ammonis. GD = dentate gyrus. SC = Schaffer säkerheter. S radiatum = stratum radiatum. B, framkallar Elektrisk stimulering av SC (en CA3 axon tarmkanalen) ett stimulanspaket artefakt, följdes nästan omedelbart av en presynaptisk befolkning spik, eller fiber volley (FV). Amplituden på FV är direkt proportionell mot antalet SC aktiverade fibrer. Lutningen av den negativa pågående fasen av fältet excitatoriska postsynaptiska potentialen (EPSP) motsvarar direkt till aktivering av depolariserande synaptisk strömmar i CA1 pyramidala nervceller som svar på glutamat släppa från SC terminaler. C Överlappande representant extracellulära vågformer in i CA1 stratum radiatum svar på nio olika nivåer stimulusintensitet (30 till 500 μA) i en "hälsosam" (till vänster), "ohälsosam" och "hyperexciterbara" slice. Fem vågformer var i genomsnitt per nivå. Friska skivor reagera dynamiskt över denna stimulans utbud och uppvisar ett enda positivt pågående befolkningen spik (som avspeglar CA1 neuronala urladdning) på de högre stimulans nivåer. I RC22 nedsänkning kammaren, maximal EPSPS avståndet vanligtvis 1,5 till 3 mV i amplitud. Ohälsosamma skivor (mitten panel) uppvisar ofta en stor FV, men en liten maximal EPSP (<1 mV) och oftast visar dålig plasticitet. Hyperexciterbara skivor (högra panelen) visar två eller flera regenerativ befolkningen spikar i rakt uppstigande delen av den EPSP. Svaren i hyperexciterbara skivor är ofta labil och är steglöst påverkas av LTD / LTP stimulering.
Figur 5. Representant elektrofysiologi experiment utförts på akuta skivor från mitten av åldern (16 mån) APP/PS1 möss och äldre (22 mån) Fisher 344 råttor. Paneler AB visar data från APP/PS1 möss som behandlats med en kontroll Adeno-associerad (AAV) virala konstruera (Control) eller en roman AAV reagens (Reagent A) som har utvecklats av vårt laboratorium grupp. Jämfört med kontrollgruppen skiva, segmentet som behandlas med Reagens A uppvisar en märkbar vänstervridning i EPSP: FV kurvan (A) tyder på ökad synaptisk styrka. Den Reagent-A-behandlade slice visar också robust och stabil LTP (B) efter leverans av två 1 sek, 100 Hz stimulans tåg, medan kontrollen slice uppvisar brister LTP, typiskt för denna djurmodell. Paneler DF visa data som samlats in från två enskilda år råttor som fick kronisk (4 veckor) intrahippocampal perfusion av fordon eller en ny anti-inflammatorisk substans (Drug A). Basal synaptisk styrka var relativt opåverkad av läkemedelsbehandling(D). Men Drug A var mycket effektiv på att förhindra induktion av LTD (E). Paneler C och F visar representativa EPSP vågformer in från enskilda skivor före (för) och 60 min efter (post) leverans av LTP / LTD stimulering. Observera att stimulans artefakter inte visas.
Discussion
De steg som beskrivs i detta protokoll kommer att hjälpa försäkra att hjärnan dissektioner utförs minst lika snabbt och effektivt i år, som i unga vuxna råttor. Vi tillhandahåller också tillräckligt noggrant för nybörjaren att starta egna skiva studier på LTP och LTD. Om ytterligare utforskning av åldrande och förändringar AD i synaptisk funktion och plasticitet är ett av dina mål, det finns minst två andra metodfrågor, nämndes ovan, som förtjänar ytterligare övervägande. Först flera laboratorier har visat att Ca 2 +: Mg 2 +-förhållandet i inspelningen ACSF kan ha en markant effekt på induktion synaptisk plasticitet i hippocampus skivor 2,10,24,25. I däggdjur CSF, Ca 2 +: Mg2 + är ungefär en (se t.ex. 26). Men ACSF Ca 2 +: Mg2 + nyckeltal närmare 2 används ofta i slice studier av synaptisk funktion och plasticitet. I början av studierna var denna praxis antagligen anpassade för att optimera induktion av LTP, sedan därefter blev rutin för alla plasticitet studier. Dock kan denna praxis vara problematiskt i åldrande och AD studier på grund av väldefinierad skillnader i neuronala Ca 2 +-förordningen. Specifikt +-släpp Ca 2 + inflöde och / eller Ca 2 +-inducerad Ca 2 är förhöjda i åldern råttor och / eller AD möss modellen under neuronal aktivering 3,27-31. Induktion av LTD är särskilt känslig för subtila förändringar i ACSF Ca 2 + nivåer. Vår-protokollet, som använder 2mm Ca 2 + och 2 mm Mg 2 +, resulterar vanligtvis i en LTD för åldern, men inte unga vuxna djur 2, medan studier med en Ca 2 +: Mg2 + förhållandet närmare två, har observerat robust LTD i vuxna i avsaknad av en åldersskillnad 2,10 eller i kombination med reducerad LTD i åldern råttor 32. Dessa iakttagelser belyser behovet av att noga överväga ACSF Ca 2 + och Mg 2 + nivå när man jämför Ca2 +-beroende plasticitet i åldrarna och unga vuxna djur.
Den andra metodologiska frågan gäller det starka beroendet av LTP på postsynaptiska depolarisation 33 och möjliga åldrande / genotyp skillnader i synaptisk styrka. I en typisk LTP experiment baslinjen och LTP stimulering intensitet är i allmänhet anpassas för att producera en halv maximal (eller tre kvartal maximal) EPSP amplitud. Det potentiella problemet är att äldre råttor och APP/PS1 möss brukar uppvisa minskad synaptisk styrka i förhållande till sina yngre och / eller vild typ motsvarigheter, vilket innebär att utgångsläget EPSP värderingar kommer också att vara mindre i åldern råttor och APP/PS1 möss. Mindre EPSPS kan översätta till mindre depolarisation under LTP stimulering, vilket resulterar i en minskad sannolikhet för att framkalla LTP 33. På grund av denna potential förväxla är det svårt att avgöra om dessa djur uppvisar en genomströmning underskott, en plasticitet underskott eller båda. Det är, kan LTP induktion mekanismer i åldrarna och / eller APP/PS1 möss vara funktionellt intakta (inga plasticitet underskott), men otillräckligt stimuleras (throughput underskott) under dessa förhållanden. Denna distinktion är avgörande, liksom mekanismer för genomströmning och mekanismer för plasticitet kan svara mycket olika på en specifik farmakologisk behandling. Vi försöker att minimera effekterna av minskad genomströmning på LTP induktion genom normalisering av EPSP amplituden på samma nivå (t.ex. 1 mV) på alla skivor innan LTP stimulering. Andra strategier kan vara effektiva samt (t.ex. användning av spänning eller strömtång att utjämna membranpotential i grupper under LTP stimulering), och bör övervägas vid utredning av LTP i dessa djurmodeller.
Disclosures
Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av Leica Microsystems.
Acknowledgments
Arbetet stöds av NIH bidrag AG027297, en utmärkelse från Kentucky ryggmärgen och Head Injury Research Trust, och en gåva från Kleberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| KH2PO4 (monobasic) | Sigma-Aldrich | P5379-100G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| CaCl2 (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3306-250G | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | |
| C6H12O6 (dextrose) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| Table 1. Reagents required | |||
| Erlenmeyer Flasks | Fisher Scientific | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
| Aquarium Bubbler | Used for oxygenating media. Available at most pet stores | ||
| 50 mL Glass beaker | Fisher Scientific | 02-540G | For brain storarge in ACSF |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Small Animal Guillotine | World Precision Instruments, Inc. | DCAP-M | |
| Flat paper towel | |||
| #11 Feather surgical blade | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| Beebee bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Lempert Rongeurs | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8321 | Use for rats |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16020-14 | Use for mice or rats |
| Hippocampus tool | Fine Science Tools | 10099-15 | |
| Spoon | A plastic teaspoon will do | ||
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | Spatula |
| Surgical iris scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| plastic transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-43 | |
| 110mm Whatman filter paper | Fisher Scientific | 09-805E | Whatman cat. 1001-110 |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | ||
| Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome | Vibratome | VT1000P | |
| 0.1mm FA-10 Feather S blade | Ted Pella, Inc. | 121-9 | 0.1mm FA-10 Feather S blade |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) | Fisher Scientific | 13-678-20A | For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening |
| 35 mm Polysterine Culture dish | Corning | 430588 | Used for collecting slices after dissection |
| Table 2. Tools and materials for dissection | |||
| Holding chamber | Custom Made | ||
| P-97 Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday cage | Custom Made | ||
| Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm | Corning | 1220-1L | |
| Gravity-contolled IV set with regulator | Baxter Internationl Inc. | 2C8891 | |
| Central Vacuum Line | Available in most modern labs | ||
| 95% O2 / 5% CO2 Gas Mix | Scott-Gross Co. | ||
| TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery | Fisher Scientific | Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes. | |
| Eclipse E600FN Microscope | Nikon Instruments | with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters | |
| Cool Snap ES Digital Camera | Photometrics | Cool Snap ES Digital Camera | |
| X-Cite Fluorescent Illuminator | EXFO | X-Cite Fluorescent Illuminator | |
| Microscope Platform | Siskiyou, Inc. | Custom assembled | |
| RC-22 Submersible recording chamber | Warner Instruments | 64-0228 | Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner) |
| TC2BIP 2/3Ch Temperature controller | Cell Microcontrols | ||
| 4 Axis Manual Miniature manipulator | Siskiyou, Inc. | ||
| Platinum Iridium Wire (0.002 in) | World Precision Instruments, Inc. | PTT0203 | |
| A365 Stimulus Isolator | World Precision Instruments, Inc. | A365 Stimulus Isolator | |
| Multiclamp 700b Amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1322A A/D converter | Axon Instruments | ||
| PClamp software | Axon Instruments | ||
| Personal Computer (Pentium 4) | Dell | ||
| Table 3. Electrophysiology equipment and materials | |||
References
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
- Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
- Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
- Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
- Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
- Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
- Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
- Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
- Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
- Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
- Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
- Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
- Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
- Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
- Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
- Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
- Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
- Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
- Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
- Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
- Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
- Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
- Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
- Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
- Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
- Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
- Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
- Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
- Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
- Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
- McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).
