Summary
Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수 있습니다
Abstract
Plasmodium의 기생충, 말라리아의 원인이되는 대리인은 만 250 새로운 감염이 매년 발생하는 감염 아노 펠 레스 모기의 물린 통해 전송됩니다. 연구의 수십에도 불구하고, 말라리아에 대한 백신도 새로운 제어 전략의 필요성을 강조 아직 없습니다. 한 혁신적인 접근은 효과적으로 말라리아 기생충 전송을 제어하는 유전자 조작 모기를 사용하는 것입니다. 대상 돌연변이 유발을 통해 모기의 세포 신호 전달 경로의 고의적인 변경은, 기생충 개발 1 조절 발견되었습니다. 이러한 연구에서, 우리는 변화를위한 잠재적인 유전자 목표를 식별하기 시작할 수 있습니다. 타겟 돌연변이 유발은 전통적으로 대상 유전자와 대형 DNA 분자 사이의 동종 재조합에 의존하고 있습니다. 그러나, 안정적으로 변형 세포 라인의 생성 등 복잡한 DNA 분자의 건설 및 사용은 비용, 시간 소요 종종 비효율적이다. 따라서, 고정 핵산 - 수정 oligonucleotides (LNA 기능)을 사용하여 전략 episomal 및 염색체 DNA의 유전자 타겟 (2 검토)에 인공 단일 염기 대체를 소개하는 유용한 대안을 제공합니다. LNA - ON - 중재 대상으로 돌연변이 유발은 효모와 생쥐 3,4 모두 교양 세포에 대한 관심의 유전자에 변이 점을 소개하기 위해 사용되었습니다. 우리는 LNA 기능이 아노 펠 레스 gambiae과 아노 펠 레스 stephensi 세포 모두에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현에 파란색 형광 단백질 (BFP) 표현에서 스위치로 이어지는 transfected episomal 대상에서 하나의 염기 변화를 소개하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시 . 이 변환은 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발 효과가 LNA 기능에 의해 중재이 기술은 체외에서 생체내의 염색체 돌연변이 유발 타겟에 적용 될 수있는 제안이 될 수 있다고 처음으로 보여줍니다.
Protocol
- 이전 프로토콜을 시작하기 위해서는 실험에 사용되는 모기 세포가 건강하고 ~ 80 %의 합류에서 자기편 경우 (그림 1). 것을 확인하는 것이 중요합니다 자란하거나 건강하지 못한 세포는 낮은 transfection 효율의 결과하고 일관성 결과를 줄 것이다.
- 30 분 28 ° C의 물을 욕조에 사용하기 전에 모든 미디어를 따뜻하게.
- 멤, 얼의 W / 글루타민 5 % 열 inactivated FCS, 0.2 % D - 글루코오스, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신의 항생제,, 1 %가 아닌 - 필수 아미노산 : A. stephensi MSQ43 세포 E5 매체를 필요로합니다.
- 슈나이더의 Drosophila 중간 5 % 열 inactivated FCS,, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신의 항생제 : A. gambiae SUA5B 전지는 S2 매체를 필요로
- 해동 얼음의 모든 transfection 시약 재료, plasmids, 그리고 oligonucleotides를 저장합니다.
- 모든 절차는 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다.
- 자기편 세포 (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) 세포를 방해하지 않고 이전 미디어를 대기음 들어, 28 예열되어 신선한 미디어의 상당 볼륨을 추가 ° C 다음의 맨 아래에서 세포를 씻어 내 버리지 피펫을 사용하여 플라스크.
- 세포의 농도는 결정과 1x10 6 세포 / ML의 최종 농도 조정해야합니다. transfection 시약 자료를 준비하는 동안 세포는 상온에서 보관하실 수 있습니다.
- 6 잘 플레이트의 각 잘하는 모기 세포 (1x10 6 셀 / ML) 1 ML을 추가합니다. 각 실험 조건 (아래 참조)에 대한 번호판을 설정합니다.
표 나는 일반적인 transfection을위한 pipetting 방식입니다. 표 II는 BFP 특정 LNA 기능을 사용하여 단일 염기의 돌연변이 유발에 대한 성공적인 테스트 다섯 조건을 설명합니다. 첫 번째 두 pGFP 및 pBFP은 각각 양극과 음극을 제어합니다. 나머지는 BFP 특정 LNA 기능의 증가 농도와 pBFPs의 실험 조건입니다. 12 단계 8 각 상황에 따라 시약의 적절한 볼륨을 추가합니다. - 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 플라스미드 DNA를 전송 및 EC 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다.
- 1 μL 플라스미드 DNA (1 μg / μL)의 경우, EC 버퍼 99 μL를 추가합니다.
- 1 μL pGFP (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼 99 μL를 추가합니다.
- 1 μL pBFP (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼 99 μL를 추가합니다.
- 1 μL pBFP (μL / 1μg) 및 1 μL (μg / μL)의 경우, EC 버퍼의 98 μL를 추가합니다.
- 1 μL pBFP (μL / 1μg) 및 5 μL (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼의 94 μL를 추가합니다.
- 1 μL pBFP (μL / 1μg)와 10 μL (μL / 1μg)의 경우, EC 버퍼 89 μL를 추가합니다.
- 그런 다음 천천히 사용되는 DNA 1 μg 당 향상제를 추가합니다.
- 1 μL 플라스미드 DNA의 경우, 8 μL 향상제를 추가합니다.
- 1 μL pGFP 들어, 8 μL 향상제를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 들어, 8 μL 향상제를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 1 μL의 경우, 16 μL 향상제를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 5 μL의 경우, 48 μL 향상제를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 10 μL 들어, 88 μL 향상제를 추가합니다.
- 1 초과 솔루션의 모든 튜브의 맨 아래에 있는지 확인을 위해 소용돌이 DNA / 버퍼 / 확장기는 혼합물. 그렇다면 5 분 실온에서 품어.
- 10 초 1 μg 플라스미드 DNA와 와동 당 Effectene 시약을 추가합니다. 솔루션의 모든 10 분 상온에서 부화 후 튜브의 하단에하고 있는지 확인합니다.
- 1 μL 플라스미드 DNA를 10 μL Effectene를 (표 I) 추가합니다.
- 1 μL pGFP 들어, 10 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다.
- 1 μL pBFP 들어, 10 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다.
- 1 μL pBFP 1 μL의 경우, 20 μL Effectene (표 II)를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 5 μL의 경우, 60 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다.
- 1 μL pBFP 10 μL의 경우, 110 μL Effectene를 (표 II) 추가합니다.
- DNA / 버퍼 / 확장기 / Effectene 혼합물에 dropwise 예열 미디어를 추가하여 1000 μL의 최종 볼륨 각 튜브를 가져와. 미디어가 너무 신속하게 추가하면 DNA 수있다는이 시점에서 침전물. 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다.
- 1 μL 플라스미드 DNA 들어, 882 μL 미디어 (표 I) 추가합니다.
- 1 μL pGFP 들어, 882 μL의 미디어 (표 II)를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 들어, 882 μL의 미디어 (표 II)를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 1 μL 들어, 864 μL 미디어 (표 II)를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 5 μL 들어, 792 μL 미디어 (표 II)를 추가합니다.
- 1 μL pBFP 10 μL 들어, 702 μL 미디어 (표 II)를 추가합니다.
- 다음 천천히 잘 각 한 번에 한 방울에 해당하는 DNA / 확장기 / Effectene 혼합 1 ML를 추가합니다.
- 소용돌이는 플레이트 부드럽게 세포 transfection 혼합물의 균일한 분배를 보장합니다. Incubat정상적인 성장 조건에서 전자 세포.
- 어느날 transfection 후 부드럽게 미디어를 대기음 천천히 신선한 예열 미디어의 상당 볼륨 바꿉니다. 이렇게하면 우물의 하단에있는 세포 레이어를 방해하지 않는 것이 중요합니다.
- transfection 후 이틀 transfection 효율 (그림 2)를 확인하기 위해 형광 현미경 pGFP와 transfected 긍정적인 제어 세포를 검사합니다.
- SUA5B 전지는 매우 빠르게 성장하고 우거져 될 것입니다. 나흘 기존의 미디어를 aspirating 갓 예열 미디어 천천히 상응하는 볼륨을 추가하여 transfection 얇은 이러한 세포 후에.
- 우물에 새로운 미디어를 추가하면 최대 pipeting하여 각 우물의 바닥에서 모든 세포를 분리하고 아래로, 세포의 혼합물의 절반 볼륨 (1 ML)를 버리고 2 최종 볼륨을 가지고 신선한 예열 미디어 1 ML을 추가 ML.
- 필요한 얇은, 그들은 건강하고 자란되지 않도록 매일 세포를 확인하십시오.
- 세포 분석을 수집하기 전에 5~7일 게시물 transfection을위한 정상적인 조건에서 성장을 허용합니다.
- 5~7일 게시물 transfection에서 모든 우물에서 이전 미디어를 aspirating 각 잘하는 살균 방 온도 PBS 1 ML을 추가하여 세포를 수집합니다.
- 그리고 아래로 pipetting하여 우물의 바닥에서 세포를 분리 5 ML 스냅 캡 튜브에 세포 혼합물을 전송하고 즉시 유동세포계측법를 통해 세포를 분석할 수 있습니다.
대표 결과
그림 1. Untransfected 건강한 A. stephensi MSQ43 (A)와 A. 약 80 %에 합류 gambiae SUA5B (B) 세포.
그림 2. A. stephensi MSQ43 (A)와 A. gambiae SUA5B (B) 세포가 플라스미드을 표현하는 긍정적인 제어와 GFP transfected.
그림 3. BFP 특정 잠금 핵산 - 수정 oligonucleotides (LNA 기능)과 단일 염기 다음 transfection의 돌연변이 유발을 통해 GFP에 BFP의 전환을 확인 유동세포계측법 데이터입니다. SUA5B 세포는 대조군으로 (pBFP) 플라스미드를 표현 BFP와 긍정적인 제어로 플라스미드를 표현 GFP (pGFP)와 transfected 또는 pBFP 및 BFP 특정 LNA 기능의 증가 농도로했다. 왼쪽에서 오른쪽으로 표시 유동세포계측법 데이터 (A) 게이팅 전략 : 라이브 세포, propidium 요오드화물의 (PI) 부정적인 세포와 transfection 다음 GFP 양성 세포 5 일간의 기대 대 측면 산란. (B) GFP 양성 세포의 비율의 그래프는 pBFP와 LNA 기능의 증가와 함께 농도 (A) 다음과 transfection에 표시됩니다.
표 I. Transfection의 조건.
표 II. 그림 1에서 사용되는 Transfection 조건.
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Discussion
여기 A.로 LNA 기능의 transfection 다음 episomal 유전자 대상에서 단일 염기의 목표 전환에 대한 체외 방법 및 증거를 제공 stephensi 및 A. gambiae 세포. LNA - ON - 중재 유전자 변환은 사이트 특정 DNA 수리 대응의 유도가 필요합니다, 우리의 데이터는 모기 세포가 특정 사이트 돌연변이 유발이 메커니즘을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 방법 여기서 제시가 episomal 대상의 변환에 기반하지만, 우리의 데이터는 다른 시스템에서 왔습니다으로 LNA - ON - 중재 전환이 모기 세포의 염색체 목표에 대해 최적화할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 유전자 변환 따라서 복잡한 프로토콜 및 장기 약물 선택 정권없이 안정적으로 변형 모기 세포 라인의 생성을 촉진합니다. 또한, 기존 기술의 사용에 따라 mRNA 특정 살 세포에 형광 태그가 5-7 생물 학적 연구에 대한 변환 염색체 유전자의 목표와 모기 세포를 정렬하고 풍요롭게하기 위해 이용할 수 있습니다.
이 방법의 성공은 비판적 70-80%의 밀도에 건강한 세포의 사용에 따라 달라집니다. 또한, 모든 단계에서 transfection 과정에서 그것은 플라스미드하거나 LNA 기능도이 침전물에 대한 시각 솔루션을 선택하여 솔루션을 밖으로 시켰던 것을 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜 중 하나는 가능한 수정 판 24 시간 이전에 transfection 과정을 시작하는 세포이다. 이것은 속도가 느린 성장 또는 민감한 세포 라인에 대한 제안입니다. 우리는 LNA 기능에 플라스미드 DNA의 최적 비율 1시 5분 것을 발견하지만 각각의 새로운 유전자 및이자의 세포 라인에 대한 이상적인 비율을 결정하는 것이 중요합니다.
연구의 다양한 모기 loci 및 말라리아 기생충의 감염 8-10에 대한 저항력을 부여하는 유전자를 발견했습니다. 면 이러한 목표는 조작 의무가 있습니다 -의 향상이나 표현 타이밍의 리디렉션을 통해 - 그들은 자연 벡터 집단에서 말라리아 기생충 전송을 제어하는 전략으로 유전 공학에 대한 기초를 제공할 수 있습니다. 여기서 설명하는 방법은 실험실에서 말라리아 저항 유전자에 변이를 도입을위한 소설과 효과적인 기술입니다. 관심 유전자의 이러한 조작을 통해, 우리는 유전자 제품은 체외, 생체내에서 말라리아 기생충 개발의 이해 제어에 중요한 단계에서 휴대폰 백신 기생충 응답을 변경하는 방법 구체적으로 결정할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 유동세포계측법 그녀 도움 캘리포니아 국립 메이트 연구 센터에서 애비 스피너 감사하고 싶습니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 보건 국립 연구소 (NIH) AI073745, AI080799 및 AI078183의 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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