Summary
Oligonucleotides ניתן להשתמש כדי לאתר ספציפי תחליף נוקלאוטיד בודד של גני מטרה transfected בשני
Abstract
טפילים Plasmodium, הסוכן סיבתי של מלריה, המועברות דרך עקיצות של יתושים נגועים אנופלס וכתוצאה מכך יותר מ -250 מיליון זיהומים חדשים בכל שנה. למרות עשורים של מחקר, אין עדיין חיסון נגד מלריה, המדגישה את הצורך של אסטרטגיות שליטה רומן. גישה אחת היא השימוש החדשני של יתושים מהונדסים גנטית כדי לשלוט ביעילות טפיל המלריה הילוכים. שינויים מכוונת של המסלולים התא איתות היתוש, דרך mutagenesis ממוקד, נמצאו להסדיר טפיל הפיתוח 1. מתוך מחקרים אלה, אנו יכולים להתחיל לזהות מטרות הגן פוטנציאל לשינוי. Mutagenesis ממוקד הסתמכה באופן מסורתי על רקומבינציה הומולוגיים בין גן המטרה מולקולת דנ"א גדולים. עם זאת, הבנייה והשימוש כגון מולקולות דנ"א מורכבות עבור הדור של שורות תאים הפך ביציבות הוא זמן יקר, רב יעיל לעתים קרובות. לכן, האסטרטגיה באמצעות נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA לפיירפוקס) מספק אלטרנטיבה יעילה מציגה תחליפים מלאכותיים נוקלאוטיד בודד לתוך episomal ו כרומוזומליות הגן מטרות DNA (הנסקרת ב 2). LNA-ON בתיווך mutagenesis ממוקד נעשה שימוש כדי להציג את נקודת מוטציות בגנים עניין של תאים בתרבית שמרים והן בעכברים 3,4. אנחנו מראים כאן LNA-RSS יכול לשמש כדי להציג שינוי של נוקלאוטיד יחיד מטרה episomal transfected כי התוצאות מתג מכחול ביטוי חלבון פלואורסצנטי (BFP) לירוק ביטוי פלורסנט חלבון (GFP) הן gambiae אנופלס ו אנופלס תאים stephensi . המרה זו ממחישה בפעם הראשונה כי mutagenesis יעיל של גני מטרה בתאים יתוש יכולה להיות מתווכת על ידי LNA תוספות ומציע כי טכניקה זו עשויה להיות ישימה mutagenesis מטרות כרומוזומליות במבחנה in vivo.
Protocol
- לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב כדי לקבוע כי התאים יתוש השתמשו בניסוי בריאים בנקודת המפגש ~ 80% אם חסיד (איור 1). התאים מגודלים או לא בריא תגרום יעילות transfection נמוך ייתן תוצאות לא עקביות.
- חימום בכל אמצעי התקשורת לפני שימוש באמבט מים C ° 28 במשך 30 דקות.
- א stephensi MSQ43 תאים דורשים E5 בינוני: ממ, של ארל w / גלוטמין, חום FCS מומת 5%, 0.2% D-גלוקוז, 1% פניצילין, האנטיביוטיקה סטרפטומיצין, ו -1% שאינם חיוניים חומצות אמינו.
- א gambiae תאים SUA5B דורשים בינוני S2: תסיסנית שניידר בינוני, חום FCS מומת 5% ו -1% פניצילין, האנטיביוטיקה סטרפטומיצין
- הפשירי ולאחסן כל מגיב transfection חומרים, פלסמידים, ו oligonucleotides על הקרח.
- כל הנהלים צריכים להתבצע במנדף תרבות רקמות באמצעות טכניקה סטרילית.
- עבור תאים חסיד (א gambiae SUA5B, א stephensi MSQ43) לשאוב את התקשורת הישנים מבלי להפריע את התאים, להוסיף נפח המקבילה של התקשורת טרי כי כבר חימם עד 28 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את התאים מלמטה של הבקבוק באמצעות פיפטה.
- ריכוז של תאים צריך להיקבע תוך התאמה ריכוז סופי של 1x10 6 תאים / מ"ל. תאים יכולים להישמר בטמפרטורת החדר בעת הכנת חומרי מגיב transfection.
- הוסף 1 מ"ל של תאים יתוש (1x10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6 באר. הגדרת צלחת עבור כל תנאי הניסוי (ראה להלן).
לוח ט היא ערכת pipetting עבור transfection כללית. טבלה II מתאר חמישה תנאים כדי לבדוק mutagenesis מוצלח של נוקלאוטיד יחיד באמצעות BFP ספציפי LNA-RSS. שני הראשונים, ואת pGFP pBFP, הן בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. הנותרים הם תנאי הניסוי של pBFPs עם ריכוז גדל והולך של BFP ספציפי LNA-RSS. בשנת צעדים 8 עד 12, להוסיף כמויות מתאימות של מגיב בהתאם לכל מצב. - העברת פלסמיד דנ"א כדי צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ולהוסיף נפח מתאים של חיץ EC.
- עבור 1 פלסמיד דנ"א μL (1 מיקרוגרם / μL), להוסיף 99 μL של חיץ EC.
- עבור pGFP 1 μL (1μg / μL), להוסיף 99 μL של חיץ EC.
- עבור pBFP 1 μL (1μg / μL), להוסיף 99 μL של חיץ EC.
- עבור pBFP 1 μL (1μg / μL) ו 1 μL ON (מיקרוגרם / μL), להוסיף 98 μL של חיץ EC.
- עבור pBFP 1 μL (1μg / μL) ו 5 μL ON (1μg / μL), להוסיף 94 μL של חיץ EC.
- עבור pBFP 1 μL (1μg / μL) ו 10 μL ON (1μg / μL), להוסיף 89 μL של חיץ EC.
- ואז לאט לאט להוסיף Enhancer לכל 1 מיקרוגרם של ה-DNA בשימוש.
- עבור 1 פלסמיד דנ"א μL, להוסיף 8 Enhancer μL.
- עבור pGFP 1 μL, להוסיף 8 Enhancer μL.
- עבור pBFP 1 μL, להוסיף 8 Enhancer μL.
- עבור pBFP 1 μL ו 1 μL ON, להוסיף 16 Enhancer μL.
- עבור pBFP 1 μL ו 5 μL ON, להוסיף 48 Enhancer μL.
- עבור pBFP 1 μL ו 10 μL ON, להוסיף 88 Enhancer μL.
- וורטקס DNA / חיץ / Enhancer התערובת במשך 1 sec ולוודא את כל הפתרון הוא בתחתית של התחתית. ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף מגיב Effectene לכל DNA 1 מיקרוגרם מערבולת פלסמיד עבור 10 שניות. ודא כי כל הפתרון הוא בתחתית של התחתית ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- עבור 1 פלסמיד דנ"א μL, להוסיף 10 Effectene μL (טבלה I).
- עבור pGFP 1 μL, להוסיף 10 Effectene μL (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL, להוסיף 10 Effectene μL (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL ו 1 μL ON, להוסיף 20 Effectene μL (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL ו 5 μL ON, להוסיף 60 Effectene μL (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL ו 10 μL ON, להוסיף 110 Effectene μL (טבלה II).
- תביאו כל צינור לנפח הסופי של μL 1000 על ידי הוספת התקשורת חיממה dropwise לתערובת הדנ"א / חיץ / Enhancer / Effectene. ה-DNA עשויה לזרז בשלב זה אם התקשורת היא הוסיפה מהר מדי. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- עבור 1 פלסמיד דנ"א μL, להוסיף מדיה 882 μL (טבלה I).
- עבור pGFP 1 μL, להוסיף מדיה 882 μL (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL, להוסיף מדיה 882 μL (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL ו 1 μL ON, להוסיף 864 μL התקשורת (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL ו 5 μL ON, להוסיף 792 μL התקשורת (טבלה II).
- עבור pBFP 1 μL ו 10 μL ON, להוסיף מדיה 702 μL (טבלה II).
- הבא לאט להוסיף 1 מ"ל של תערובת ה-DNA / Enhancer / Effectene מתאים לכל אחד גם טיפה בכל פעם.
- מערבולת הצלחת בעדינות כדי להבטיח התפלגות אחידה של תאים תערובת transfection. Incubatדואר התאים בתנאים צמיחה נורמלית.
- יום אחד לאחר transfection, לשאוב בעדינות את המדיה לאט להחליף עם נפח שווה ערך של התקשורת חיממה טרי. חשוב לא להפריע את שכבות התאים בחלק התחתון של בארות המים בעת ביצוע פעולה זו.
- יומיים לאחר transfection לבחון תאים בקרה חיובית transfected עם pGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע יעילות transfection (איור 2).
- תאים SUA5B לגדול מהר מאוד יהפכו מגודל. ארבעה ימים לאחר דקה transfection תאים אלה על ידי aspirating את התקשורת הישנה והוספת לאט נפח המקבילה של התקשורת חיממה טרי.
- לאחר הוספת המדיה החדשה של בארות, לנתק כל התאים מתחתית היטב על ידי כל pipeting למעלה ולמטה, לזרוק חצי נפח (1 מ"ל) של התערובת בתא ולהוסיף 1 מ"ל של התקשורת חיממה טריים להביא את הכרך האחרון 2 מ"ל.
- בדוק תאים יומי כדי לוודא שהם בריאים ולא מגודל, דקה לפי הצורך.
- אפשר התאים לגדול בתנאים רגילים עבור transfection ימים 06:55 הודעה לפני לאסוף אותם לניתוח.
- בשלב transfection ימים 5-7 לפרסם, לאסוף את התאים על ידי aspirating את התקשורת הישנה בכל הבארות והוספת 1 מ"ל סטרילי בטמפרטורת החדר PBS היטב כל אחד.
- ניתוק תאים מתחתית היטב על ידי pipetting מעלה ומטה העברת תערובת התא 5 הצמד צינורות מ"ל כובע ומיד לנתח תאים באמצעות cytometry הזרימה.
נציג תוצאות
איור 1 א. בריא Untransfected stephensi MSQ43 (A) וא ' gambiae SUA5B (ב) תאים בנקודת המפגש כ -80%.
איור 2 א. stephensi MSQ43 (A) וא ' gambiae SUA5B (ב) תאים transfected עם GFP בקרה חיובית לבטא פלסמיד.
איור 3. Cytometry זרימת נתונים המאשר ההמרה של BFP ל-GFP דרך mutagenesis transfection של נוקלאוטיד יחיד הבאים עם BFP ספציפי נעול גרעין חומצה שונה oligonucleotides (LNA-RSS). תאים SUA5B היו transfected עם GFP להביע פלסמיד (pGFP) כביקורת חיובית, עם BFP להביע פלסמיד (pBFP) כביקורת שלילית, או עם pBFP ריכוזי הגוברת של BFP ספציפי LNA לפיירפוקס. (א) gating אסטרטגיה cytometry זרימת הנתונים מראה משמאל לימין: פיזור קדימה לעומת הצד של תאים חיים, יודיד propidium (PI) תאים שלילי, ותאי ה-GFP חיובית בחמשת הימים הבאים transfection. (ב) גרף של אחוז התאים ה-GFP חיובי שמוצג transfection (א) הבא עם pBFP ריכוזי הגוברת של LNA-RSS.
לוח ט התנאים transfection.
טבלה II. Transfection תנאי שימוש באיור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה במבחנה ראיות המרה ממוקד של נוקלאוטיד יחיד יעד הגן episomal הבאים transfection של LNA לפיירפוקס לתוך A. stephensi וא gambiae תאים. LNA-ON בתיווך המרה הגן דורש גיוס של אתר ספציפי בתגובה DNA תיקון: הנתונים שלנו מצביעים על כך התאים יתוש יכול לתמוך זה מנגנון mutagenesis אתר ספציפי. בעוד השיטה המוצגת כאן מבוססת על המרה של יעד episomal, הנתונים שלנו מצביעים על כך LNA-ON בתיווך ההמרה יכול להיות מותאם עבור מטרות כרומוזומליות בתאים יתוש כפי שהיה במערכות אחרות. המרה ג'ין, אם כן, יקל על דור של שורות תאים הפך ביציבות יתוש בלי פרוטוקולים מורכבים ארוך מבחר המשטרים סמים. יתר על כן, הטכנולוגיה הקיימת מבוססת על שימוש של mRNA ספציפי תגי פלורסנט בתאים חיים ניתן למנף למיין ולהעשיר את התאים יתוש עם המרה מטרות הגן כרומוזומליות למחקרים ביולוגיים 5-7.
ההצלחה של שיטה זו תלויה באופן קריטי על השימוש בתאים בריאים בצפיפות של 70-80%. בנוסף, על כל השלבים בתהליך transfection חשוב כדי לקבוע כי לא פלסמיד או LNA לפיירפוקס יש זירז את הפתרון על ידי בדיקת פתרון ויזואלי עבור המשקע. אחת שינוי אפשרי של פרוטוקול זה היא הצלחת תאים 24 שעות לפני תחילת תהליך transfection. זה הציע איטי שורות תאים גדל או רגיש. מצאנו כי היחס האופטימלי של ה-DNA פלסמיד ל LNA לפיירפוקס היה 1:05 אבל זה יהיה חשוב כדי לקבוע את יחס אידיאלי עבור כל גן חדש שורת תאים של עניין.
מגוון מחקרים זיהו לוקוסים יתושים גנים המקנים עמידות טפיל המלריה 8-10 זיהום. אם יעדים אלה ניתנים למניפולציה - דרך להגברת או ניתוב מחדש של עיתוי הביטוי - הם יכולים לשמש בסיס הנדסה גנטית כאסטרטגיה לשלוט טפיל המלריה שידור באוכלוסיות וקטור טבעי. המתודולוגיה דנו כאן היא שיטה חדשנית ויעילה החדרת מוטציות בגנים התנגדות מלריה במעבדה. באמצעות מניפולציות של גנים אלה של עניין, אנו יכולים לקבוע במפורש כיצד מוצרי גן לשנות הסלולר נגד הטפיל התגובות במבחנה, שלב קריטי לשליטה והבנה של התפתחות טפיל המלריה in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אבי ספינר במרכז הלאומי לחקר פרימטים קליפורניה לסיוע שלה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי מימון מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI073745, AI080799 ו AI078183.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
