Summary
Изготовление, калибровка и использование неинвазивной вибрирующих зонды для измерения биоэлектрического тока в различных биологических системах описывается.
Abstract
Электрические поля, порожденного активный транспорт ионов, присутствуют во многих биологических системах и часто выполняют важные функции в тканях и органах. Например, они играют важную роль в управлении миграции клеток при заживлении ран. Здесь мы описываем изготовление и использование сверхчувствительных вибрирующих зонды для измерения внеклеточной электрические токи. Зонд изолированные, заточенная металлическая проволока с небольшим платины черным кончиком (30-35 мкм), которые могут обнаружить ионного тока в мкА / см 2 диапазон в физиологическом растворе. Датчик вибрации при температуре около 200 Гц с помощью пьезоэлектрического попойки. В присутствии ионного тока, датчик обнаруживает разность потенциалов между крайностями его движения. Синхронный усилитель отфильтровывает посторонние шумы, заблокировав на частоте зонда вибрации. Данные записываются на компьютер. Датчик калибруется на начало и конец эксперимента в соответствующих солевых, используя камеру, которая применяется ток 1,5 мкА точно / см 2. Мы опишем, как сделать зонды, настроить систему и калибровки. Мы также продемонстрировать технику роговицы измерения, а также показать некоторые репрезентативные результаты из разных образцов (роговицы, кожи, мозга).
Protocol
1. Зонд Производство
Пустые зондов закупаются у инструменты Всемирного Precision (Elgiloy / нержавеющая Parylene покрытием микроэлектродов) (см. "Таблица специфических реагентов и оборудования» ниже). Зонд сократить 25-30 мм за наконечник и около 5 мм Parylene изоляции на срез разгреб скальпелем (# 11 лезвие) для обеспечения хорошей связи. Зонд установлен в золото R30 разъем использованием электропроводящих серебристо-загружалась эпоксидных (например, Rite-Lok SL65) [* см. примечание ниже]. Зонд хранится ночь при комнатной температуре, чтобы эпоксидная, чтобы укрепиться. Далее, зонда с покрытием из золота и платины, то с помощью нано-усилитель мощности питания. Зонда промыть в ацетоне и подключен к отрицательному выходу из нано-усилитель мощности источника. Зонда рассматривается под микроскопом рассекает (x40) и занял первое место в золотом решение покрытие (калий dicyanoaurate (0,2% вес / Кау (CN) 2 в дистиллированной воде (дН 2 O)). Ссылкой провод подсоединен к положительному выход и поместили в раствор завершает цепь. ток 5 нА применяется в течение 5 мин, затем увеличилась до 20 нА до кончика составляет примерно половину желаемого конечного размера (около 10-15 мкм). зонда промыть в дН 2 O, а затем помещается в platinizing решение (платинохлористоводородной гидратов кислоты, 1% вес / H2PtCl6 * 6H 2 O), а также свинца (II) ацетат тригидрат (0,1% вес / Pb (СН3СО 2) 2 * 3H 2 O 2 в дН O). ток 250 нА применяется в течение 5 мин, затем увеличилась до 500 нА до кончика составляет около 80% от желаемого конечного размера. увеличении тока до 1 мкА и применяются в 1 всплески сек до конечного диаметра наконечника получается (около 30-35 мкм). Наконец, наконечник промыть в дН 2 Зонды О. можно хранить при комнатной температуре на неопределенный срок. Если зонды повреждены, золото R30 разъемы могут быть использованы повторно.
[* Примечание: Некоторые датчик системы зонд монтажа подключается непосредственно к усилителю для передачи сигнала. Другие системы имеют отдельные точки крепления и сигнальных разъема. В последнем случае, короткие (2-3 см) провод с разъемом R30 на одном конце припаян к первому разъему R30 до установки датчика (см. рис 2А).]
2. Зонд системы
Зонда прикреплен к пьезоэлектрических Бендер установлен на 3-мерные микро-позиционер (рис. 1). Зонд вибрация контролируется вибрирующих питания датчика силы, которая также позволяет регулировать амплитуду колебаний и частоты. Снабжение питанием пробника, передает опорный сигнал для синхронного усилителя, который также отображает частоты колебаний и угла сдвига фаз. Это также полезно для подключения осциллографа так что имеет быструю визуальную ведения вибрацию зонда. Сигнал с датчика поступает в синхронный усилитель. Зондом и образцом для измерения могут быть просмотрены с рассекает микроскопом (увеличение x6 до x40) с волоконно-оптической подсветкой. Во время калибровки и измерений образцов, ведения и земли (земля) провод должен быть в растворе (см. рис 2В). Усилитель подключен к компьютеру через аналогово-цифровой (I / O) интерфейс. Данные записываются использованием всей программы сотовый Стратклайд электрофизиологии Software (WinWCP).
Блокировка усилителем параметры: чувствительность [200 мкВ], динамическое разрешение [обычный], смещение [по] Развернуть [x1], постоянная времени: предварительное [10 с], почта [0,1 с]. Если более быстрый отклик не требуется, предварительно Постоянная времени может быть сокращен до 3 сек Смещение контроль используется для внесения зонда трассировки недалеко от центра экрана. Если большие ответы, как ожидается, след можно перемещать вверх или вниз.
ВКП настройках программного обеспечения: Запись Продолжительность [204,8 ов], сэмплов на канал [1024], интервал [0,2 с], диапазон напряжения [+ / - 0,2 V]. Если большие токи, как ожидается, Диапазон напряжения может быть увеличена до 1 В или 5 В.
3. Зонд Настройки
Новые зонды должны быть проверены и их уникальные частоты и угла сдвига фаз определяется. Новый зонд помещается в камеру, содержащую калибровки физиологического раствора (рис. 2В). Питание включается и частоты оказались до максимальной вибрации не наблюдается. Это резонансная частота зонда. Использование датчика на этой частоте может привести к нестабильности и производят шум в записи, так что зонд «де-настроенные" путем вычитания 10 Гц, чтобы дать рабочей частоты датчика (как правило, 150-200 Гц). Амплитуда колебаний регулируется так, чтобы расстояние зонд вибрации так же, как диаметр кончика, так что, когда зонд вибрирует "двойной образ" зонда видны (см. Рисунок 2B). Для определения угла сдвига фаз, зонд помещается в физиологическом растворе при калибровке камеры и ток 1,5 мкА / см 2, примененной несколько раз. Фазового угла на синхронный усилитель настроен пока нет ответа. Добавление и вычитание 90 ° к этойугол дает максимальный эффект, и этот угол рабочего фазового угла зонда. Частоты и угла сдвига фаз для каждого зонда отметить для будущего использования. Во время эксперимента, важно, чтобы эти настройки угла частоты, амплитуды и фазы не меняются, так как это изменит ответ зонда. Для удобства, когда ток течет "Юг-Север», то это должно производить отклонение вверх (называемого здесь «пик») в записи следа, а ток, протекающий "Север-Юг" должен показать вниз отклонение ( рис. 3А). Если это неправильный путь, а затем добавить 180 ° до угла сдвига фаз будет исправить это, щелкая ответы раунде. Смотрите Рейд и др. 1. Подробную информацию о теории позади зонда функции, калибровка и т.д.
Калибровка: реакция зонда "стандартизированных" ток ровно 1,5 мкА / см 2, на зонде в калибровочной камеры, используется для расчета тока в образце (см. рис 2Б, 3А). До измерения пробы, датчик откалиброван в соответствующее решение, например, BSS + Искусственный Решение Tear для роговицы. Текущий применяется в двух направлениях: Юг-Север и Север-Юг, производя вверх и вниз отклонения, соответственно, что эквивалентно внешних и внутренних течений, в зависимости от ориентации образца. Зонд следа должна иметь стабильные базовые и низкий уровень шума (ср. рис. 3A и 3B). Датчик калибруется в конце эксперимента использовали раствор, чтобы компенсировать изменение осмолярности за счет испарения. При анализе данных, измерения от первой половине эксперимента можно вычислить с помощью начиная калибровочные значения и измерения со второй половины рассчитывается конце калибровки.
Пример измерения: камеры может быть разработана для хранения и обездвижить образца. Например, на рисунке 3C показывает чашки Петри с проволочной петли, чтобы держать глаза на роговицу измерений. Блюдо с физиологическим раствором помещают под микроскоп и рассекает область интереса на образец, помещенный в фокусе в поле зрения. Зонд помещается в раствор и ориентированы параллельно поверхности образца, а также в центре внимания, так что на том же уровне, что и точки на образце должна быть измерена. Зонд перемещается, насколько это удобно (например, 1-2 см) от образца, вибрация включена (и компьютерного программного обеспечения настроена на запись) создать стабильное (горизонтальная) базовой линии (рис. 4А). Зонд затем переехал в положение измерения, около 50 мкм от поверхности. Когда новый ('пик') значение стабильной, зонд вернулся в исходное положение и след возвращается к исходному уровню. Это может повторяться через определенные моменты времени производить timelapse данных, или образец переехал / повернуты немного и повторяется в разных местах для получения пространственного отображения текущих данных (см. Рисунок 4б, 5б).
Анализ данных: Данные анализируются с помощью WinWCP (рис. 5А). Линия "нуля" красной горизонтальной перемещается вверх или вниз, так что параллельно следа базовой до измерения пика. Вертикальная зеленая линия измерительная перемещаемых через следу базовой линии. Выход чтения в зеленой внизу зеленая линия должна быть близка к нулю (например, 0,00012). Эта цифра показывает differnce между точкой, где красные и зеленые линии пересекаются, а синий след. Красная линия, затем перешел, пока не будет параллельно с вершины пика. Зеленый чтении выход размер пика в мВ. Данные для всех измерений пиков и калибровки данных, которые введены в таблицу Microsoft Excel шаблон (см. Таблицу 1). Соответствующую информацию, такую как дата, номер датчика, диапазон напряжения (VR), решение, используемое, измерительные позиции, временных точках, и т.д. также могут быть помещены в таблицу. Текущее направление (в или из образца: 'I / O') отмечается, и внутрь токов приведены также отрицательное значение в колонке «пик». Тока в правом столбце рассчитывается по формуле: ток = пик * (1.5/calibration), где 1,5 является ток в мкА / см 2, примененной при калибровке. Таким образом: "unw1 '= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 мкА / см 2.
4. Секреты успеха
Как и во всех электрофизиологии, правильного заземления (заземление) жизненно оборудования помогает устранить шум. Таким образом, по крайней мере микро-позиционером и шасси Микроскоп должен быть заземлен, а может быть также источником света (см. рисунок 1). Пользователь также может быть источником статического электричества, поэтому заземление через запястье-диапазона может предотвратить нестабильность зонда в некоторых случаях, но это не всегда необходимо. Клетки Фарадея не надо, как синхронный усилитель отфильтровывает все частоты (например, 60 Гц от электрической сети), кроме частоты зонд вибрирует в. Таблица виброизоляции полезно, но не существенно. Твердую, устойчивую скамью или стол, работает так же хорошо. Помимо основныхинформацию в таблицу Excel (см. выше) полезно записать в своей лаборатории книга дополнительную полезную информацию, такую как изменения температуры, наркотиков дополнения и т. д. Если фотографии сняты микроскоп, обратите внимание на увеличение. Если уместно, это также полезно привлечь эскиз образца (-ов) с указанием позиции и / или ориентации зондовых измерений (см. Рисунок 6).
Оспаривание шаги
- Зонд решений: там должен быть хороший электрический контакт между зондом и R30 разъем. Если ничего не происходит в гальванических этапе, то это, вероятно, причине.
- Калибровка: использовать соответствующие физиологическим раствором или питательной среды для пример, который будет измерять. Не избыточного или недостаточного заполнения калибровки камеры, поскольку это может изменить ответ. Поверхность жидкости должна быть плоской в верхней части камеры.
- Пример измерения: Планируйте заранее, например, вам нужно сделать специальную камеру, чтобы удерживать / крепление образца (см. рис 3C)? При измерении от образца, зонд должен быть ориентирован с длинной осью параллельно поверхности образца, так что направление зонда вибрации (и, следовательно, направление тока измеряется) перпендикулярна к поверхности образца (например, см. рисунок 4B ). Образец можно перемещать и / или поворачивать для измерений в различных позициях. Важно поддерживать стабильное расстояние между зондом и поверхностью образца при измерении. Измеренный ток пропорционально расстоянию от поверхности образца, при движении зонда от поверхности образца, ток падает по закону обратных квадратов. То есть, при измерении тока, генерируемого на поверхности образца, текущие обнаружена обратно пропорциональна квадрату расстояния от поверхности. Окуляр сетки можно использовать для оценки расстояния между зондом и поверхностью образца.
Поиск неисправностей
- Проблема: не реагирует на калибровку. Решение: Проверьте солевой связывается с обоими электродами. Проверьте аккумулятор постоянного тока калибратора.
- Проблема: малый ответ. Решение: чистые зонда в дН 2 O и / или ацетоном. Проверьте фазового угла.
- Проблема: шум или нестабильной базовой линии (рис. 3В). Решение: Проверьте провода заземления.
- Проблема: след спрыгивает экране. Решение: не позволяйте зонда на ощупь образца.
5. Представитель Результаты
На рис.3 показан хороший пример того, калибровка следа. Обратите внимание на стабильные (по горизонтали) базовой линии, низкий уровень шума и широкий отклик. Для сравнения, на рисунке 3, б шумной трассы с неустойчивой линии. Текущий измерений на различных должностях в рану роговицы мышей, показаны на рис 4B. Верхняя панель показывает датчик позиции, средняя панель показывает зонд следов, записанные на компьютере и нижняя панель график токов на разных позициях, показывая профиля раны тока. На рисунке 5б показывает измерений на рану кожи мыши осуществляться через регулярные интервалы времени, чтобы произвести данные о ране текущее время курса.
Рисунок 1. Вибрационный датчик системы. См. текст для подробного описания. Синий текст описывает функцию соединительных проводов. Зеленые символы показывают точки заземления.
Рисунок 2. A. Зонд монтажа. Зонд склеиваются в золото R30 разъем с серебристо-загружалась эпоксидные, до electroporating. В некоторых системах, второй разъем с коротким проводом для передачи сигнала на припаян. Шкала бар 3 мм. Платиновой мяч не в масштабе. B. Зонд калибровки. Калибратор постоянного тока (слева) относится ток 1,5 мкА / см 2 до зонда в калибровочной камеры (справа). Слева внизу: крупный план зонда. Когда датчик вибрации (справа внизу), амплитуда регулируется таким образом двойной образ наконечник видел. Шкала бар 100 мкм.
Рисунок 3. A. Зонд калибровки следа. Пример хороший след калибровку датчика, со стабильной базовой линии, низкий уровень шума и широкий отклик. Тока, протекающего по линии Юг-Север дает отклонение вверх, и ток, протекающий Северо-Юг производит вниз отклонения. Б. нестабильны, шумные следа зонда. С. палат сделал для установки мыши (слева) или крысы (справа) глаза на роговицу измерений. Шкала бар 5 мм.
Рисунок 4. Докажите измерения примеров. А. стабильные базовые устанавливается с зонда в исходное положение 1-2 из образца. При перемещении зонда для измерения положения вблизи образца, он обнаруживаеттекущей и следа отклоняется вверх (наружу ток). Б. Измерения в различных позициях по роговицы мыши будет. Зонд ориентирован параллельно поверхности, так что вибрация перпендикулярны. Вверх пики показать внешнему токов. Максимальный ток увидеть на края раны (позиции B & F). Схема зонда показана на положение измерения F (правый край раны). Шкала бар 300 мкм.
Рисунок 5. A. Анализ зонд следов. Верхняя панель: красный нулевой линии перемещается вверх или вниз, поэтому параллельно с базовым следа, то зеленая линия измерения перемещается через к базовым так что выходные чтения в зеленой близка к нулю (0,00012). Нижняя панель: красная линия, затем перешел, пока не будет параллельно с верхней части следа пика, и выход чтение дает размер пика в мВ (12.45). Текущий рассчитывается исходя из этого, используя калибровочные данные (см. таблицу 1). Б. Мышь кожи рана timelapse данных. Текущий до ранив показано в нулевой момент времени (красный символ). Измерения были сделаны в том же положении на рану кожи мыши через регулярные timepoints после ранения. После начального переходного внутрь токов (ниже нуля), текущая вспять и внешние токи (положительный) медленно поднялся и плато.
Рисунок 6. Лаборатории книга эскизов показывает датчик измерения позиции. А. мозга крысы, красные точки показывают измерения позиции и зонд символы показывают зонд ориентации. Б. Крыса роговицы рана, красные точки показывают измерения позиции и стрелки показывают направление тока измеряется.
Таблица 1. Пример таблицы Excel для хранения и количественного зондом данные. pN2_cal1 = начиная калибровки; кал + и кал-= калибровочные значения в мВ; VR = напряжение, пиковое = выборочных измерений в мВ, I / O = расход тока (в или из выборки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем низкой стоимости, основной, но очень чувствительны вибрирующий датчик системы измерения неинвазивного электрического тока в различных биологических системах.
Возможные изменения
- Если платина / иридий электродов (инструменты Всемирного Precision; кошка # PTM23B20) используются вместо нержавеющей стали, то золото этапа покрытия могут быть устранены.
Применения
Мы использовали вибрирующий зонд для измерения электрического тока в: крыса роговицей 2; крысы объектив 3,4; мышь кожи 5; Xenopus головастика 6; человеческой кожи 7; человеческой роговицы 8; данио рерио эмбриона 1; Dictyostelium 1; мозга крыс 1. Вибрирующий зонд был впервые описан Джаффе и Nuccitelli 9. Управляемый компьютером зонд, который измеряет ток в двух измерениях было также описано 10. Соответствующие интересные отзывы были также включены 11-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарны профессору Ричарду Borgens, Центр Паралич исследований, Университет Пердью, за помощь в сборке вибрирующий датчик системы. Это исследование было поддержано НЭИ грант NIH 1R01EY019101 в МЗ и БР, и частично за счет субсидий из Калифорнийского института регенеративной медицины RB1-01417, NSF MCB-0951199, а также неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты, UC Davis офтальмологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eligoy-Stainless Electrode | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip |
| Gold R30 connector | www.vectorelect.com | R30 | Re-usable |
| Silver-loaded epoxy | 3M | SL65 | Mix 1-part Resin with 1-part Hardener |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ40 | Magnification x6 to x40 |
| Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2) | Sigma-Aldrich | 379867 | CAUTION: Toxic |
| Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O) | Sigma-Aldrich | 520896 | CAUTION: Toxic |
| Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O) | Sigma-Aldrich | 185191 | CAUTION: Toxic |
| Nano-Amp power source | Home made | - | Powered by six 1.5 V (AAA) batteries |
| 3-dimensional micro-positioner | Line Tool Co. | Model H | |
| Lock-in amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Digital I/O interface | National Instruments | PCI-6220 | |
| Shielded Connector Block with BNC connections | National Instruments | BNC-2110 | |
| Strathclyde Electrophysiology Software | University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK | WinWCP V4.1.5 | Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| Calibration Chamber | Home made | ||
| Constant Current Calibrator | Vibrating Probe Company | Powered by one 9 V (PP3) battery |
References
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).
- Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: the role of electric currents. FASEB J. 19, 379-386 (2005).
- Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electric currents and lens regeneration in the rat. Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).
- Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract. FASEB J. 19, 842-844 (2005).
- Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts. J. Invest. Derm. , (2010).
- Reid, B., Song, B., Zhao, M. Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration. Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ. 442, 457-460 (2006).
- Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes. Cornea. , Forthcoming (2010).
- Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).
- Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns. J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).
- Nuccitelli, R. Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues. Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).
- Levin, M. Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).
- Zhao, M. Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).
