Summary
La fabricación, la calibración y el uso de sondas no invasivas para medir la corriente vibratoria bioeléctrica en diversos sistemas biológicos se describe.
Abstract
Los campos eléctricos generados por el transporte activo de iones, están presentes en muchos sistemas biológicos y, a menudo tienen funciones importantes en los tejidos y órganos. Por ejemplo, desempeñan un papel importante en la dirección de la migración celular durante la cicatrización de heridas. A continuación se describe la fabricación y el uso de sondas ultrasensibles para medir la vibración extracelular corrientes eléctricas. La sonda es un cable aislado, afilado de metal con una pequeña punta de platino, negro (30-35 micras), que puede detectar las corrientes iónicas en el mA / cm 2 rango en solución salina fisiológica. La sonda se hace vibrar a cerca de 200 Hz por un doblador piezoeléctricos. En presencia de una corriente iónica, la sonda detecta una diferencia de voltaje entre los extremos de su movimiento. Un bloqueo de los filtros amplificador de los ruidos extraños por el bloqueo en la frecuencia de la sonda de vibración. Los datos se registran en el ordenador. La sonda está calibrada al inicio y al final de los experimentos en solución salina adecuada, utilizando una cámara que se aplica una corriente de 1,5 mA exactamente / cm 2. Se describe cómo hacer que las sondas, configurar el sistema y calibrar. También demuestran la técnica de medición de la córnea, y se muestran algunos resultados representativos de diferentes muestras (córnea, piel, cerebro).
Protocol
1. Sonda de Fabricación
Sondas en blanco se compran de Instrumentos de Precisión Mundial (Elgiloy / acero recubierto de microelectrodos parileno) (ver "Tabla de reactivos específicos y equipos" más adelante). La sonda se corta 25-30 mm detrás de la punta y alrededor de 5 mm de aislamiento parileno en el extremo cortado raspa con un bisturí (# 11 hojas) para asegurar una buena conexión. La sonda está montada en una de oro R30 conector con conductores de electricidad de plata cargada de epoxy (por ejemplo, Rite-Lok SL65) [* ver nota abajo]. La sonda se almacena a temperatura ambiente durante la noche para permitir que la resina se endurezca. A continuación, la punta de la sonda está chapada en oro y platino, con una fuente de alimentación nano-amperios. La punta de la sonda se limpia con acetona y se conecta a la salida negativa de una fuente de energía nano-amperios. La punta de la sonda se observa bajo un microscopio de disección (x40) y se coloca primero en la solución de enchapado en oro (dicyanoaurate de potasio (0,2% w / v UAE (CN) 2 en agua destilada (dH 2 O)). Un cable de referencia conectada al positivo de salida y se coloca en una solución completa el circuito. Una corriente de 5 nA se aplica durante 5 minutos, luego aumentó a 20 nA hasta que la punta es aproximadamente la mitad del tamaño final deseado (10-15 micras). La punta de la sonda se limpia con dH 2 O y luego se colocan en una solución de platinizing (hidrato de ácido cloroplatínico, 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O), además de plomo (II) acetato trihidrato (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3 H 2 O en DH 2 O). Una corriente de 250 nA se aplica durante 5 minutos, luego aumentó a 500 nA hasta que la punta es de aproximadamente el 80% del tamaño final deseado. La corriente es mayor a 1 mA y se aplica en un segundo hasta que estalla el diámetro de la punta final de se obtiene (alrededor de 30-35 micras). Por último, la punta se enjuaga en dH 2 O. Las sondas se pueden almacenar a temperatura ambiente por tiempo indefinido. Si las sondas están dañados, el oro R30 conectores pueden ser reutilizados.
[* Nota: Algunos sistemas de sonda tienen la sonda de montaje conectada directamente al amplificador para llevar la señal. Otros sistemas tienen un punto de montaje separado y conector de señal. En este último caso, un corto (2-3 cm) de cable con un conector R30 en un extremo se suelda a la primera R30 conector antes de montar la sonda (vea la Figura 2A).]
2. Sistema de sonda
La sonda está conectada a un doblador de piezo-eléctrico montado en un 3-dimensional de micro-posicionador (Figura 1). La vibración de la sonda está controlada por el suministro de energía de la sonda vibrante que también permite el ajuste de la amplitud de la vibración y la frecuencia. La fuente de alimentación de la sonda envía una señal de referencia para el amplificador lock-in, que también muestra la frecuencia de la vibración y el ángulo de fase. También es útil para conectar un osciloscopio lo que uno tiene una referencia visual rápida de la vibración de la sonda. La señal de la sonda va al amplificador lock-in. La sonda y la muestra a analizar se pueden ver con un microscopio de disección (aumento x6 a x40) con iluminación por fibra óptica. Durante las mediciones de calibración y de la muestra, una referencia y una tierra (la tierra) de cable debe estar en la solución (ver Figura 2B). El amplificador está conectado a un ordenador a través de un convertidor analógico digital (E / S) de la interfaz. Los datos se registran mediante el programa de células enteras Strathclyde Electrofisiología Software (WinWCP).
Lock-in amplificador de configuración: Sensibilidad [200 mV], Dynamic Resolución [normal], Offset [en], Expand [x1], la constante de tiempo: pre [10 s], después [0,1 s]. Si una respuesta más rápida es necesaria, la constante de tiempo pre se puede reducir a 3 s. El control de desplazamiento se utiliza para llevar el seguimiento de la sonda a cerca del centro de la pantalla. Si las respuestas se prevén grandes, la traza se puede mover hacia arriba o hacia abajo.
PMC configuración del software: el tiempo de grabación [204,8 s], muestras por canal [1024], intervalo de muestreo [0,2 s], Rango de voltaje [+ / - 0,2 V]. Si las grandes corrientes se prevé, el rango de voltaje se puede aumentar a 1 V o 5 V.
3. Configuración de la sonda
Nuevas sondas tienen que ser probados y se determinó su frecuencia y ángulo de fase única. La nueva sonda se coloca en la cámara de calibración que contiene suero fisiológico (Figura 2B). La fuente de alimentación está encendida y la frecuencia se presentó hasta que la vibración máxima que se observa. Esta es la frecuencia de resonancia de la sonda. Utilizando la sonda en esta frecuencia puede causar inestabilidad y producir ruido en la grabación, por lo que la sonda se "des-templado", restando 10 Hz a dar la frecuencia de trabajo de la sonda (típicamente 150 a 200 Hz). La amplitud de la vibración se ajusta de modo que la distancia de las vibraciones de la sonda es el mismo que el diámetro de la punta, de modo que cuando la sonda se hace vibrar una "doble imagen" de la punta de la sonda se observa (ver Figura 2B). Para determinar el ángulo de fase, la sonda se coloca en solución salina en la cámara de calibración y una corriente de 1,5 mA / cm 2 a menudo. El ángulo de fase en el amplificador lock-in se ajusta hasta que no hay respuesta. Sumando o restando 90 ° de la presenteángulo da la máxima respuesta, y este ángulo es el ángulo de trabajo de la sonda de fase. El ángulo de fase y frecuencia de cada sonda se caracterizan por el uso futuro. Durante un experimento, es importante que estos ajustes del ángulo de la frecuencia, amplitud y fase no se cambian, ya que esto altera la respuesta de la sonda. Para mayor comodidad, cuando la corriente está fluyendo "Sur-Norte, esto produce una desviación al alza (llamado aquí" pico ") en el seguimiento de la grabación, y la corriente que fluye" Norte-Sur "debe mostrar una desviación a la baja ( vea la Figura 3A). Si este es el camino equivocado, entonces la adición de 180 ° para el ángulo de fase lo arreglará al lanzar la ronda de respuestas. Ver Reid et al. 1 para obtener información detallada sobre la teoría detrás de la función de la sonda, calibración, etc
Calibración: La respuesta de la sonda a una «normalizada» actual de exactamente 1,5 mA / cm 2, aplicado a la sonda en una cámara de calibración, se utiliza para calcular la corriente en la muestra (véase la Figura 2B, 3A). Antes de la medición de la muestra, la sonda se calibra en la solución de su caso, por ejemplo, BSS + solución de lágrimas artificiales para la córnea. La corriente se aplica en dos direcciones: Sur-Norte y Norte-Sur, produciendo una tendencia al alza y una desviación a la baja, respectivamente, lo que equivale a las corrientes hacia el exterior y hacia adentro, dependiendo de la orientación de la muestra. El seguimiento de la sonda debe tener una línea de base estable y de bajo ruido (comparar Figs. 3A y 3B). La sonda se calibra al final del experimento en la solución utilizada para compensar el cambio de la osmolaridad debido a la evaporación. Al analizar los datos, las mediciones de la primera mitad del experimento se puede calcular utilizando los valores de calibración de partida, y las mediciones de la segunda mitad calcula utilizando la calibración final.
La medición de la muestra: una cámara que tenga que ser diseñados para mantener e inmovilizar la muestra. Por ejemplo, la figura 3C muestra placas de Petri con asas de alambre para mantener los ojos para las mediciones de la córnea. El plato que contiene suero fisiológico se coloca bajo el microscopio de disección y el área de interés en la muestra colocada en el foco en el campo de visión. La sonda se coloca en solución y en paralelo orientado a la superficie de la muestra y también en el enfoque por lo que es en el mismo nivel que el punto de la muestra a medir. La sonda se mueve por lo que es conveniente (por ejemplo, 2.1 cm) de distancia de la muestra, la vibración activada (y el software configurado para grabar) para establecer una estable (horizontal) de referencia (ver Figura 4). La sonda se mueve entonces en posición de medición, a unos 50 m de la superficie. Cuando el nuevo ("pico") el valor es estable, la sonda se mueve a la posición de referencia y la traza vuelve a la línea de base. Esto se puede repetir en los puntos regulares de tiempo para producir los datos de intervalo, o la muestra se trasladó / girar ligeramente y se repite en diferentes posiciones para obtener datos espaciales de la cartografía actual (véase la figura 4B, 5B).
Análisis de datos: Los datos se analizaron mediante WinWCP (ver Figura 5). La línea "cero" de la horizontal roja se mueve hacia arriba o hacia abajo por lo que es paralela a la línea de base antes de trazar el pico de medición. La línea vertical de medición verde se mueve a través de la línea de base de rastreo. La salida de la lectura en verde en la parte inferior de la línea verde debe ser cercano a cero (por ejemplo, 0,00012). Este número muestra la differnce entre el punto donde las líneas rojas y la Cruz Verde, y el trazo azul. La línea roja se mueve entonces hacia arriba hasta que quede paralela a la cima del pico. La lectura de salida el verde es el tamaño del pico en mV. Los datos de todos los picos de medición y los datos de calibración, se ponen en una plantilla de hoja de cálculo Microsoft Excel (ver Tabla 1). Información relevante, como la fecha, el número de la sonda, rango de voltaje (VR), solución utilizada, la medición de las posiciones, puntos de tiempo, etc también se puede poner en la hoja de cálculo. La dirección de la corriente (dentro o fuera de la muestra: "I / O) se observa, y las corrientes hacia el interior también se les da un valor negativo en el" pico "de la columna. La corriente en la columna de la derecha se calcula mediante la fórmula: = corriente máxima * (1.5/calibration), donde 1.5 es la corriente en mA / cm 2 se aplica en la calibración. Por lo tanto: "unw1 '= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 mA / cm 2.
4. Secretos para el Éxito
Como en todos los electrofisiología, puesta a tierra (conexión a tierra) de los equipos vitales ayuda a eliminar el ruido. Por lo tanto, al menos en el posicionador micro y el chasis del microscopio debe estar conectado a tierra, y quizá también la fuente de luz (ver Figura 1). El usuario también puede ser una fuente de electricidad estática, por lo que a tierra a través de una muñeca de banda se puede evitar la inestabilidad de la sonda, en algunos casos, pero no siempre es necesario. Una jaula de Faraday no es necesario, como el bloqueo de los filtros amplificador de todas las frecuencias (por ejemplo, 60 Hz de la red eléctrica), aparte de la frecuencia de la sonda está vibrando en. Una tabla de aislamiento de vibración es útil pero no esencial. Un banco sólido, estable o una tabla funciona igual de bien. Aparte de los básicosinformación en la hoja de cálculo Excel (ver más arriba) es útil para grabar en un laboratorio de libro de información adicional de utilidad, tales como cambios de temperatura, adición a las drogas, etc Si se toman fotografías al microscopio, tenga en cuenta la ampliación. En su caso, también es útil para dibujar un boceto de la muestra (s) muestra la posición y / o la orientación de las mediciones de la sonda (ver Figura 6).
Pasos desafiantes
- Sonda de hacer: debe haber una buena conexión eléctrica entre la sonda y el conector R30. Si no ocurre nada en la etapa de la galvanoplastia, entonces esto es probablemente la causa.
- Calibración: el uso de solución salina o medio de cultivo apropiado para la muestra que va a medir. No exceso o por defecto de llenado en la cámara de calibración, ya que puede alterar la respuesta. La superficie del líquido debe ser plana en la parte superior de la cámara.
- Mediciones de la muestra: Planee con anticipación, por ejemplo, hacer lo necesario para hacer una cámara especial para guardar / montaje de la muestra (ver Figura 3 C)? Cuando se mide a partir de una muestra, la sonda debe estar orientado con el eje paralelo a largo de la superficie de la muestra, de manera que la dirección de la sonda de la vibración (y por tanto la dirección de la corriente a medir) es perpendicular a la superficie de la muestra (por ejemplo, véase la Figura 4B ). La muestra se puede mover y / o rotación para las mediciones en diferentes posiciones. Es importante mantener una distancia constante entre la sonda y la superficie de la muestra en la medición. La corriente medida es proporcional a la distancia de la superficie de la muestra, ya que la sonda se aleja de la superficie de la muestra, la corriente cae por la ley del cuadrado inverso. Es decir, cuando se mide una corriente generada en la superficie de la muestra, la corriente detectada es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia desde la superficie. Un retículo se puede utilizar para calcular la distancia entre la sonda y la superficie de la muestra.
Solución de problemas
- Problema: no hay respuesta en la calibración. Solución: solución salina cheque está en contacto con los dos electrodos. Verificación de la batería en el calibrador de corriente constante.
- Problema: La respuesta de pequeños. Solución: la sonda limpia en dH 2 O y / o acetona. Comprobar el ángulo de fase.
- Problema: el ruido o la línea de base inestable (véase la Figura 3B). Solución: Compruebe los cables de puesta a tierra.
- Problema: trazar salta fuera de la pantalla. Solución: no se permite punta de la sonda de contacto de la muestra.
5. Resultados representante
La figura 3A muestra un buen ejemplo de una traza de calibración. Tenga en cuenta la estabilidad (horizontal) de referencia, bajo ruido y gran respuesta. A modo de comparación, la Figura 3B muestra una huella ruidosa con la línea base inestable. Medidas de corriente en diferentes posiciones en una herida de la córnea del ratón se muestra en la Figura 4B. El panel superior muestra la posición de la sonda, el panel del medio muestra las huellas de la sonda como se registra en la computadora y el panel inferior es un gráfico de las corrientes en las diferentes posiciones, mostrando un perfil de la herida actual. Figura 5B muestra las mediciones en una herida en la piel del ratón a intervalos regulares de tiempo para producir los datos sobre la herida de tiempo-corriente del curso.
Figura 1. Vibración del sistema de la sonda. Véase el texto para una descripción detallada. El texto en azul describe la función de los cables de conexión. Símbolos verdes muestran los puntos de puesta a tierra.
Figura 2. A. Sonda de montaje. La sonda se pega en una medalla de oro R30 conector de plata cargada de epoxy, con anterioridad a electroporating. En algunos sistemas, un segundo conector con un cable corto para llevar la señal está soldados. Barra de escala 3 mm. La bola de platino no está a escala. B. Sonda de calibración. El calibrador de corriente constante (izquierda) se aplica una corriente de 1,5 mA / cm 2 a la sonda en la cámara de calibración (derecha). Abajo a la izquierda: primer plano de una sonda. Cuando la sonda se hace vibrar (inferior derecha), la amplitud se ajusta para una imagen doble de la punta que se ve. Barra de escala 100 micras.
Figura 3. A. Sonda rastro de calibración. Ejemplo de un seguimiento de la sonda una buena calibración, con línea de base estable, bajo ruido y gran respuesta. La corriente que fluye de Sur a Norte da una desviación hacia arriba, y la corriente que fluye de Norte a Sur produce una desviación a la baja. B. Un rastro inestable, ruidoso de la sonda. C. Chambers hizo para el montaje del ratón (izquierda) o rata (derecha) para las mediciones de los ojos de córnea. Escala de 5 mm de barras.
Figura 4. Demostrar ejemplos de medición. A. Una línea de base estable se establece con la sonda en posición de referencia 1.2 de la muestra. Cuando la sonda se mueve a la posición de medición cerca de la muestra, se detecta unactual y trazar la desvía hacia arriba (hacia el exterior de corriente). Medidas B. en diferentes posiciones a través de una córnea del ratón se. La sonda está en paralelo orientado a la superficie, por lo que la vibración es perpendicular. Picos hacia arriba muestran corrientes hacia el exterior. La corriente máxima se observa en los bordes de la herida (las posiciones B y F). El esquema de la sonda se muestra en la medición de la posición F (borde de la herida la derecha). Barra de escala 300 micras.
Figura 5. A. El análisis de las huellas de la sonda. Panel superior: la línea de cero rojo se mueve hacia arriba o hacia abajo por lo que es paralela a la línea de base de seguimiento, entonces la línea de medición de color verde se mueve a través de la línea de base para la lectura de salida en verde se aproxima a cero (0,00012). Panel inferior: la línea roja se mueve entonces hacia arriba hasta que quede paralela a la cima del pico de seguimiento y la lectura de salida da el tamaño del pico en mV (12,45). Actual se calcula a partir de este uso de los datos de calibración (ver Tabla 1). B. piel de ratón herida datos timelapse. Actual antes de heridos se muestra a tiempo cero (símbolo rojo). Las mediciones se realizaron en la misma posición en una herida en la piel del ratón en los puntos de tiempo regulares después de la herida. Después de la primera corrientes transitorias hacia el interior (por debajo de cero), la corriente inversa y las corrientes hacia el exterior (positivo) se levantó lentamente y se estabilizó.
Figura 6. Libro de bocetos que muestran Lab-sonda de medición posiciones. A. cerebro de rata; puntos rojos muestran la medición de las posiciones y los símbolos de la sonda muestran la orientación de la sonda. Rata B. herida córnea; puntos rojos muestran las posiciones de medición y las flechas muestran la dirección de la corriente medida.
Tabla 1. Ejemplo de hoja de cálculo Excel para el almacenamiento y la cuantificación de datos de la sonda. pN2_cal1 = calibración inicial, cal y cal-+ = valores de calibración en mV, VR = rango de tensión, pico = medidas de la muestra en mV, i / o = flujo de corriente (dentro o fuera de la muestra).
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Discussion
Se describe un bajo costo, básico, pero muy sensible sistema de vibración de la sonda para medir de forma no invasiva la corriente eléctrica en una variedad de sistemas biológicos.
Posibles Modificaciones
- Si platino / iridio electrodos (Instrumentos del Mundo de precisión, cat # PTM23B20) se utilizan en lugar de acero inoxidable, entonces la etapa de recubrimiento de oro puede ser eliminado.
Aplicaciones
Hemos utilizado la sonda vibrante para medir la corriente eléctrica en: córnea 2 de la rata, la rata lente 3,4; la piel del ratón 5; Xenopus renacuajo 6; la piel humana 7, 8 córnea humana, un embrión de pez cebra, Dictyostelium 1; un cerebro de rata. La sonda vibrante fue descrito por primera vez por Jaffe y Nuccitelli 9. Una sonda controlada por ordenador, que las medidas actuales en dos dimensiones también se ha descrito 10. Pertinentes revisiones interesantes también se incluyen 11-13.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos con el profesor Richard Borgens, Centro de Investigación de la Parálisis, la Universidad de Purdue, en busca de ayuda en el montaje del sistema de sonda vibrante. Este estudio fue apoyado por NEI subvención del NIH 1R01EY019101 a MZ y BR, y en parte por subvenciones del Instituto de California de Medicina Regenerativa de RB1-01417, NSF MCB-0951199, y por una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera, UC Davis Oftalmología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eligoy-Stainless Electrode | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip |
| Gold R30 connector | www.vectorelect.com | R30 | Re-usable |
| Silver-loaded epoxy | 3M | SL65 | Mix 1-part Resin with 1-part Hardener |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ40 | Magnification x6 to x40 |
| Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2) | Sigma-Aldrich | 379867 | CAUTION: Toxic |
| Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O) | Sigma-Aldrich | 520896 | CAUTION: Toxic |
| Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O) | Sigma-Aldrich | 185191 | CAUTION: Toxic |
| Nano-Amp power source | Home made | - | Powered by six 1.5 V (AAA) batteries |
| 3-dimensional micro-positioner | Line Tool Co. | Model H | |
| Lock-in amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Digital I/O interface | National Instruments | PCI-6220 | |
| Shielded Connector Block with BNC connections | National Instruments | BNC-2110 | |
| Strathclyde Electrophysiology Software | University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK | WinWCP V4.1.5 | Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| Calibration Chamber | Home made | ||
| Constant Current Calibrator | Vibrating Probe Company | Powered by one 9 V (PP3) battery |
References
- Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).
- Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: the role of electric currents. FASEB J. 19, 379-386 (2005).
- Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electric currents and lens regeneration in the rat. Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).
- Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract. FASEB J. 19, 842-844 (2005).
- Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts. J. Invest. Derm. , (2010).
- Reid, B., Song, B., Zhao, M. Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration. Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ. 442, 457-460 (2006).
- Reid, B., EO, G. raue-H. ernandez, Mannis, M. J., Zhao, M. Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes. Cornea. , Forthcoming (2010).
- Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).
- Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns. J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).
- Nuccitelli, R. Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues. Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).
- Levin, M. Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).
- Zhao, M. Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration. Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).
