Summary
A fabricação, calibração e uso de sondas não-invasivo para medir a corrente de vibração bioelétrica em diversos sistemas biológicos é descrito.
Abstract
Campos elétricos, gerados pelo transporte ativo de íons, estão presentes em muitos sistemas biológicos e, muitas vezes têm funções importantes em tecidos e órgãos. Por exemplo, eles desempenham um papel importante no direcionamento da migração celular durante a cicatrização de feridas. Aqui, descrevemos a produção e uso de ultra-sondas para medir a vibração extracelular correntes elétricas. A sonda é um isolado, fio de metal com uma ponta afiada platina preta pequena (30-35 mm), que pode detectar correntes iónicas na mA / cm 2 na faixa de soro fisiológico. A sonda é vibrado em cerca de 200 Hz por um bender piezoelétricos. Na presença de uma corrente iônica, a sonda detecta uma diferença de tensão entre os extremos do seu movimento. Um lock-in filtros do amplificador para fora o ruído estranho, bloqueando para frequência da sonda de vibração. Os dados são gravados no computador. A sonda é calibrada no início e final dos experimentos em solução salina adequada, utilizando uma câmara que se aplica uma corrente de 1,5 mA exatamente / cm 2. Descrevemos como fazer as sondas, configurar o sistema e calibrar. Nós também demonstrar a técnica de medição da córnea e mostrar alguns resultados representativos de amostras diferentes (córnea, cérebro, pele).
Protocol
1. Sonda Fabricação
Sondas em branco são comprados de Instrumentos de Precisão Mundial (Elgiloy / aço revestido Parileno microeletrodos) (ver «Quadro de reagentes e equipamentos específicos" abaixo). A sonda é cortado 25-30 mm atrás da ponta e cerca de 5 mm de isolamento Parileno no final corte raspado com um bisturi (lâmina # 11) para garantir uma boa conexão. A sonda é montada em um conector R30 ouro utilizando eletricamente condutivo epóxi prata-carregado (por exemplo, Rite-Lok SL65) [* ver nota abaixo]. A sonda é armazenado durante a noite a temperatura ambiente para permitir que o epóxi para endurecer. Em seguida, a ponta da sonda é revestida com ouro e platina, em seguida, usando uma fonte de alimentação nano-ampères. A ponta da sonda é lavado em acetona e conectado à saída negativo de uma fonte de energia nano-ampères. A ponta da sonda é visto sob um microscópio de dissecação (x40) e colocada em primeiro lugar em solução chapeamento de ouro (dicyanoaurate de potássio (0,2% w / v Kau (CN) 2 em água destilada (dH 2 O)). Um fio de referência ligado ao positivo saída e colocados em solução completa o circuito. Uma corrente de 5 nA é aplicado por 5 min, depois aumentou para 20 nA até que a ponta é de cerca de metade do tamanho final desejado (cerca de 10-15 mm). A ponta da sonda é lavado em dH 2 O e, em seguida, colocados em solução platinizing (hidrato de ácido chloroplatinic; 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O), além de chumbo (II) trihidrato de acetato (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O 2 em dH O). Uma corrente de 250 nA é aplicado por 5 min, depois aumentou para 500 nA até que a ponta é de aproximadamente 80% do tamanho final desejado. A corrente é aumentada para 1 mA e aplicada em 1 seg rajadas até o diâmetro ponta final é obtida (cerca de 30-35 mm). Finalmente, a dica é lavado em dH 2 O. Sondas podem ser armazenar à temperatura ambiente por tempo indeterminado. Se sondas estão danificados, o ouro R30 conectores podem ser reutilizados.
[* Nota: Alguns sistemas têm sonda a sonda de montagem conectado diretamente ao amplificador para transportar o sinal. Outros sistemas têm um outro ponto de montagem eo conector de sinal. Neste último caso, um fio (2-3 cm) curto com um conector R30 em uma extremidade é soldada ao conector R30 primeiro antes da montagem da sonda (ver Figura 2A).]
2. Sistema de sonda
A sonda é conectada a um bender piezo-elétrico montado em um 3-dimensional posicionador micro (Figura 1). Vibração sonda é controlada pelo fornecimento de energia vibrando sonda que também permite o ajuste da amplitude de vibração e frequência. A fonte de alimentação da sonda envia um sinal de referência para o amplificador lock-in, que também exibe a freqüência de vibração e ângulo de fase. Também é útil para conectar um osciloscópio de modo um tem uma referência visual rápida da vibração da sonda. O sinal da sonda vai para o amplificador lock-in. A sonda e amostra a ser medida pode ser visto com um microscópio de dissecação (ampliação x6 para x40), com iluminação de fibra ótica. Durante as medições de calibração e de amostra, uma referência e um fio terra (terra) deve estar na solução (ver Figura 2B). O amplificador é conectado a um computador através de um analógico-digital interface (i / o). Os dados são gravados usando o programa Strathclyde Eletrofisiologia Software de células inteiras (WinWCP).
Lock-in configurações do amplificador: Sensibilidade [200 mV], resolução dinâmica [normal], Offset [on], Expand [x1], Constante de Tempo: pré [10 s], post [0,1 s]. Se uma resposta mais rápida é necessária, o tempo de pré constante pode ser reduzido a 3 s. O controle de deslocamento é usado para trazer o rastreamento de sonda para perto do centro da tela. Se as respostas são esperadas grandes, o rastreamento pode ser movida para cima ou para baixo.
Configurações WCP software: Duração Record [204,8 s], amostras por canal [1024], intervalo de amostragem [0,2 s], Faixa de Tensão [+ / - 0,2 V]. Se grandes correntes são antecipados, a Faixa de tensão pode ser aumentada para 1 V ou 5 V.
3. Configurações de sonda
Novas sondas têm de ser testados e sua freqüência única e ângulo de fase determinada. A nova sonda é colocada na câmara de calibração contendo soro fisiológico (Figura 2B). A fonte de alimentação está ligado e virou a freqüência até a vibração máxima é observada. Esta é a freqüência de ressonância da sonda. Usando a sonda nessa freqüência pode causar instabilidade e produzir ruído na gravação, para que a sonda é "de-tuned", subtraindo 10 Hz para dar frequência de trabalho da sonda (tipicamente 150-200 Hz). A amplitude de vibração é ajustado para que a distância da vibração da sonda é o mesmo que o diâmetro da ponta, de modo que quando a sonda é vibrou uma "imagem dupla" da ponta da sonda é visto (ver Figura 2B). Para determinar o ângulo de fase, a sonda é colocada em solução salina na câmara de calibração e uma corrente de 1,5 mA / cm 2 aplicada repetidamente. O ângulo de fase no amplificador lock-in é ajustado até que não haja resposta. Adição ou subtração de 90 ° a estaângulo dá a resposta máxima, e este ângulo é o ângulo da sonda fase de trabalho. O ângulo de freqüência e fase para cada sonda são anotados para uso futuro. Durante um experimento, é importante que essas configurações de ângulo de amplitude, freqüência e fase não são alteradas, pois isso irá alterar a resposta da sonda. Por conveniência, quando a corrente está fluindo "Sul-Norte", este deve produzir uma deflexão para cima (chamado aqui "pico") no rastreamento de gravação e corrente que flui 'Norte-Sul' devem mostrar uma deflexão para baixo ( ver Figura 3A). Se este é o caminho errado, em seguida, adicionando 180 ° para o ângulo de fase irá corrigi-lo, lançando a rodada de respostas. Ver Reid et al. 1 para obter informações detalhadas sobre a teoria por trás da função do teste, calibração, etc
Calibração: A resposta da sonda a um "padrão" atual de exatamente 1,5 mA / cm 2, aplicada à sonda em uma câmara de calibração, é utilizada para calcular a corrente na amostra (ver Figura 2B, 3A). Antes da medição da amostra, a sonda é calibrada em solução adequada, por exemplo, BSS + Solução de lágrimas artificiais para córnea. Corrente é aplicada em duas direções: Sul-Norte e Norte-Sul, produzindo um para cima e uma deflexão para baixo, respectivamente, equivalentes a correntes exterior e interior, dependendo da orientação da amostra. O traço sonda deve ter uma base estável e de baixo ruído (compare Figs. 3A e 3B). A sonda é calibrada no final do experimento em solução utilizada para compensar a mudança osmolalidade devido à evaporação. Ao analisar os dados, as medições da primeira metade do experimento pode ser calculada usando os valores de calibração de partida, e as medições da segunda metade calculada usando a calibração final.
Medição da amostra: A câmara pode ter de ser concebido para segurar e imobilizar a amostra. Por exemplo, a Figura 3C mostra placas de Petri com alças de arame para segurar os olhos para medições de córnea. O prato contendo soro fisiológico é colocado sob o microscópio de dissecação e da área de interesse na amostra colocada em foco no campo de visão. A sonda é então colocado em solução e paralelo ao da superfície da amostra e também em foco, ele está no mesmo nível que o ponto da amostra a ser medida. A sonda é movida na medida em que é conveniente (por exemplo 1-2 cm) de distância da amostra, a vibração ligada (eo software de computador configurado para gravar) para estabelecer uma linha de base (horizontal) estável (ver Figura 4A). A sonda é então colocado em posição de medição, cerca de 50 mm da superfície. Quando o novo valor ("pico") é estável, a sonda é movido para a posição de referência eo traço retorna ao valor basal. Isto pode ser repetido em momentos regulares para produzir dados timelapse, ou se a amostra movidos / rodado levemente e repetidas em diferentes posições para produzir dados espaciais mapeamento atual (veja a Figura 4B, 5B).
Análise de dados: Os dados são analisados utilizando WinWCP (ver Figura 5A). Linha "zero" o vermelho horizontal é movida para cima ou para baixo assim que é paralela à linha de base traço antes do pico de medição. A linha de medição vertical verde é movido transversalmente à linha de base de rastreio. A saída de leitura em verde na parte inferior da linha verde deve ser perto de zero (por exemplo, 0,00012). Esse número mostra a differnce entre o ponto onde as linhas vermelha e verde cruz, eo traço azul. A linha vermelha é então movido para cima até que esteja paralela com o topo do pico. A leitura de saída verde é o tamanho do pico em mV. Os dados para todos os picos de medição, e os dados de calibração, são colocadas em um modelo de planilha do Microsoft Excel (ver Tabela 1). Informações relevantes, tais como a data, o número de sondagens, faixa de voltagem (VR), solução utilizada, medindo posições, tempo de pontos, etc, podem também ser colocados na planilha. A direção atual (dentro ou fora da amostra: 'i / o) é observado, e as correntes internas também recebem um valor negativo no "pico" da coluna. A corrente na coluna da direita é calculada utilizando a fórmula: = corrente de pico * (1.5/calibration) onde 1,5 é a corrente em aplicar 2 mA / cm a calibração. Assim: "unw1 '= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 mA / cm 2.
4. Segredos para o Sucesso
Como em todos os eletrofisiologia, aterramento (aterramento) do equipamento vital ajuda a eliminar o ruído. Assim, pelo menos o posicionador micro-e o chassi do microscópio deve ser aterrado, e talvez também a fonte de luz (ver Figura 1). O usuário também pode ser uma fonte de eletricidade estática, então de terra através de um pulso de banda pode evitar a instabilidade da sonda, em alguns casos, mas não é sempre necessário. Uma gaiola de Faraday não é necessário, como o lock-in filtros do amplificador para fora todas as freqüências (por exemplo 60Hz da rede elétrica), além da freqüência da sonda está vibrando menos. A mesa de isolamento de vibração é útil mas não essencial. Um banco sólido, estável ou tabela funciona tão bem. Para além do básicoinformações na planilha Excel (veja acima) é útil para gravar em um laboratório do livro informações úteis adicionais, tais como mudanças de temperatura, adições de drogas, etc Se as fotografias são tiradas pelo microscópio, observe a ampliação. Se relevante, também é útil para desenhar um esboço da amostra (s) mostrando a posição e / ou orientação de medições da sonda (ver Figura 6).
Passos desafiador
- Probe fazer: deve haver uma boa conexão elétrica entre a sonda eo conector R30. Se nada acontecer na fase de galvanoplastia, então este é provavelmente a causa.
- Calibração: use soro fisiológico apropriado ou meio de cultura para a amostra será de medição. Não sobre-ou sub-preencher a câmara de calibração, pois isso pode alterar a resposta. A superfície do líquido deve ser plana na parte superior da câmara.
- Medições da amostra: Planeje com antecedência, por exemplo, que você precisa para fazer uma câmara especial para segurar / montagem da amostra (ver Figura 3C)? Quando se mede a partir de uma amostra, a sonda deve ser orientado com o eixo paralelo tempo para a superfície da amostra, para que direção da sonda de vibração (e, portanto, sentido da corrente que está sendo medido) é perpendicular à superfície da amostra (por exemplo, ver Figura 4B ). A amostra pode ser movido e / ou girado para medições em diferentes posições. É importante manter uma distância consistente entre a sonda ea superfície da amostra durante a medição. A corrente medida é proporcional à distância da superfície da amostra, como a sonda se afasta da superfície da amostra, a corrente cai pela lei do inverso do quadrado. Isto é, quando se mede uma corrente gerada na superfície da amostra, a corrente detectada é inversamente proporcional ao quadrado da distância da superfície. Uma retícula ocular pode ser usado para julgar a distância entre a sonda ea superfície da amostra.
Solução de problemas
- Problema: não há resposta à calibração. Solução: verificação salina é entrar em contato com ambos os eletrodos. Verificação da bateria no calibrador corrente constante.
- Problema: a resposta de pequeno porte. Solução: sonda limpa em / e dH 2 O ou acetona. Verifique ângulo de fase.
- Problema: ruído ou linha de base instável (ver Figura 3B). Solução: Verifique os fios de ligação à terra.
- Problema: trace salta fora da tela. Solução: não permitem ponta da sonda para tocar amostra.
5. Resultados representante
Figura 3A mostra um bom exemplo de um traço de calibração. Observe a linha de base (horizontal) estável, baixo ruído e grande resposta. Como comparação, a Figura 3B mostra um traço ruidosos com base instável. Medições de corrente em diferentes posições em uma ferida da córnea do rato são mostrados na Figura 4B. O painel superior mostra as posições da sonda, o painel do meio mostra os traços da sonda como registrado no computador eo painel inferior é um gráfico das correntes em diferentes posições, mostrando um perfil de ferida atual. Figura 5B mostra medições em uma ferida da pele de camundongos feitos em intervalos regulares de tempo para produzir dados sobre a ferida do tempo atual curso.
Figura 1. Vibratório sistema de sonda. Veja o texto para descrição detalhada. Texto azul descreve a função dos fios de conexão. Símbolos verdes mostram os pontos de ligação à terra.
Figura 2. A. Sonda de montagem. A sonda é colado em um conector R30 ouro com prata-carregado epóxi, antes electroporating. Em alguns sistemas, um segundo conector com um fio curto para transportar o sinal é soldada por diante. Barra de escala 3 mm. A bola platina não está em escala. B. calibração da sonda. O calibrador de corrente constante (à esquerda) se aplica uma corrente de 1,5 mA / cm 2 para a sonda na câmara de calibração (direita). Canto inferior esquerdo: close-up de uma sonda. Quando a sonda é vibrado (inferior direito), a amplitude é ajustada para uma imagem dupla da ponta é visto. Barra de escala 100 mm.
Figura 3. A. Sonda traço de calibração. Exemplo de um traço boa sonda de calibração, com linha de base estável, baixo ruído e grande resposta. Corrente que flui do Sul para o Norte dá uma deflexão para cima, e corrente que flui Norte-Sul produz uma deflexão para baixo. B. Uma instável, trace sonda ruidosos. C. Chambers fez para mouse de montagem (à esquerda) ou rato (direito) para medições de olhos córnea. Barra de escala 5mm.
Figura 4. Prove exemplos de medição. A. A linha de base estável é estabelecida com a sonda em posição de referência 02/01 a partir da amostra. Quando a sonda é movida para posição de medição perto da amostra, detectar umcorrente e desvia o traço para cima (exterior atual). Medidas B. em diferentes posições através de uma córnea de rato seria. Sonda se paralelo à superfície, de modo a vibração é perpendicular. Picos para cima mostram correntes para fora. Corrente máxima é visto nas bordas da ferida (posições B & F). O esquema da sonda é mostrado na medição F posição (borda da ferida direita). Barra de escala 300 mm.
Figura 5. A. Analisar traços da sonda. Painel superior: a linha vermelha zero é movida para cima ou para baixo assim que é paralela à linha de base de rastreio, então a linha de medição verde é movido transversalmente à linha de base para a leitura de saída em verde está perto de zero (0,00012). Painel inferior: a linha vermelha é então movido para cima até que esteja paralela com o topo do pico de rastreamento e a leitura de saída dá o tamanho do pico em mV (12.45). Corrente é calculado a partir deste utilizando os dados de calibração (ver Tabela 1). B. da pele do rato ferida dados timelapse. Atual antes de ferir é mostrado no momento zero (símbolo vermelho). As medições foram feitas na mesma posição em uma ferida na pele do rato em intervalo de tempo regular após ferindo. Depois de transiente inicial correntes para dentro (abaixo de zero), a corrente invertida e correntes para fora (positivo) subiu lentamente e plateaued.
Figura 6. Lab-book esboços que mostram sonda de medição posições. A. cérebro Rat; pontos vermelhos mostram medindo posições e símbolos sonda mostram a orientação da sonda. B. ferida córnea Rat; pontos vermelhos mostram as posições de medição e setas indicam direção da corrente medida.
Tabela 1. Exemplo de planilha Excel para armazenar e quantificação de dados da sonda. pN2_cal1 calibração = partida; + cal e cal = valores de calibração em mV; VR = faixa de tensão, o pico de medições em mV = amostra, i / o = fluxo de corrente (dentro ou fora da amostra).
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Discussion
Nós descrevemos um baixo custo, básico, mas o sistema sonda altamente sensível para a medição de vibração não-invasiva de corrente elétrica em uma variedade de sistemas biológicos.
Modificações possíveis
- Se platina / irídio eletrodos (Instrumentos de Precisão Mundial; # cat PTM23B20) são usados em vez de aço inoxidável, em seguida, o palco revestimento de ouro pode ser eliminada.
Aplicações
Temos usado a sonda vibratória para medir a corrente elétrica em: córnea de ratos 2; lente de rato 3,4; pele do rato 5; Xenopus girino 6; pele humana 7; córnea humana 8; embrião Zebrafish 1; Dictyostelium 1; um cérebro de rato. A sonda vibratória foi primeiramente descrita por Jaffe e Nuccitelli 9. A sonda controlado por computador que mede a corrente em duas dimensões foi também descrita 10. Relevantes opiniões interessantes também estão incluídos 11-13.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Estamos gratos ao Professor Richard Borgens, Centro de Pesquisa Paralysis, Purdue University, para ajudar na montagem do sistema de sonda vibratória. Este estudo foi suportado pelo NIH NEI conceder 1R01EY019101 para MZ e BR, e em parte por concessões do California Institute of Medicina Regenerativa RB1-01417, NSF MCB-0951199, e por uma concessão irrestrita de Pesquisa para prevenir a cegueira, UC Davis Oftalmologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eligoy-Stainless Electrode | World Precision Instruments, Inc. | SSM33A70 | 76 mm, 7 MΩ, 1-2μm tip |
| Gold R30 connector | www.vectorelect.com | R30 | Re-usable |
| Silver-loaded epoxy | 3M | SL65 | Mix 1-part Resin with 1-part Hardener |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ40 | Magnification x6 to x40 |
| Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2) | Sigma-Aldrich | 379867 | CAUTION: Toxic |
| Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O) | Sigma-Aldrich | 520896 | CAUTION: Toxic |
| Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O) | Sigma-Aldrich | 185191 | CAUTION: Toxic |
| Nano-Amp power source | Home made | - | Powered by six 1.5 V (AAA) batteries |
| 3-dimensional micro-positioner | Line Tool Co. | Model H | |
| Lock-in amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Digital I/O interface | National Instruments | PCI-6220 | |
| Shielded Connector Block with BNC connections | National Instruments | BNC-2110 | |
| Strathclyde Electrophysiology Software | University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK | WinWCP V4.1.5 | Free download from: http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm |
| Calibration Chamber | Home made | ||
| Constant Current Calibrator | Vibrating Probe Company | Powered by one 9 V (PP3) battery |
References
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- Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electric currents and lens regeneration in the rat. Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).
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