Summary
이 문서는 유전자 전달 연구와 IVIS의 bioluminescence 이미징을 사용하여 유전자 발현의 후속 분석을 위해 환자의 조직 조각의 문화에 대해 설명합니다.
Abstract
이 동영상은 유전자 전달 연구를위한 전직 생체내 모델로 환자 조직의 사용에 대해 설명합니다. 수술 시에 얻은 신선한 환자 조직은 슬라이스와 문화에 유지됩니다. 전 생체내 모델 시스템은 그대로 환자 조직 및 유전자 발현이 IVIS 탐지 시스템을 사용 bioluminescence 이미징으로 분석됩니다으로 유전자의 물리적인 전달을 허용합니다. 발광 생물 감지 시스템은 조직의 희생을 필요없이 각각의 조각 내의 유전자 발현의 신속하고 정확한 부량을 보여줍니다. 이 슬라이스 조직 문화 시스템은 정상 및 악성 조직을 포함한 조직 유형의 다양한 사용하고 우리는 그대로 조직의 이질적인 자연과 개별 환자 간의 다양성의 높은 수준의 효과를 연구하기 위해 수 있습니다. 이 모델 시스템은 동물 모델의 대안으로 임상 시험을 입력하기 전에 보완 잠복기 모드와 같은 특정 상황에서 사용될 수 있습니다.
Protocol
미디어 시약의 준비
- 항생제 솔루션
인산은 200 U / ML 페니실린, 200 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML fungizone와 호수 (PBS)를 버퍼 - 수집 및 처리 매체
Dulbecco의 200 U / ML 페니실린과 수정 독수리 중간 (DMEM), 200 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML fungizone - 문화 매체
컬렉션 매체는 열 inactivated 태아 소 혈청 10 % 포함
I. 조직 수집과 저장
환자 조직의 수집에 대한 승인은 코르크 교육 병원의 임상 연구 윤리위원회로부터 얻은 정보와 동의는 환자 수술 전날로부터 얻은 것입니다. 간 조직은 악성 질병에 대한 부분 hepatectomy을받은 환자로부터 얻은 것입니다.
- 신선한 환자 조직은 수술 절제술 시에 얻을 수 있습니다.
- 조직 4 컬렉션 미디어에 저장됩니다 ° C (조직까지 생존의 중요한 손실없이 12 H 위해 냉장 보관있을 수 있습니다, 그러나 즉시 처리가 권장됩니다.)
II. 조직 슬라이스 준비와 문화
칼자국은 vibratome (Leica, 독일)를 사용하여 수행되었습니다. 조직 깔끔히 시스템은 제조 업체의 지시에 따라 사용되었습니다. 조직 슬라이스 준비 70 % 2 - 프로파놀과 청소 악기를 사용하여 살균 후드 아래에서 수행되었다. 슬라이스 두께 2000 미크론에서 설정하고 22-26 RPM에서 왕복 블레이드를 사용하여 절단합니다.
- 조직은 항생제 용액에 세 번 씻어입니다.
- 조직은 무독성 접착제 (Dermabond)를 사용하여 설치 단계에 첨부되어 있습니다.
- 슬라이스 두께가 설정되고 깔끔히는 22-26 RPM에서 이루어진다.
- 슬라이스가 37 6 - 잘 문화 요리 (물론 당 한 슬라이스)의 문화 매체에 유지 ° C humidified 환경에서 5 % CO 2.
III. 조직 조각에 유전자 전달
- 슬라이스 2 H에 대한 ° C 이전의 치료에 37 미리 incubated입니다.
- 문화 매체는 치료 매체로 대체됩니다.
- 조각 직접 바이러스 벡터 (바이러스 입자의 25 μl Ad5.CMVluc [1x10 9]).을 주사 또는 입자는 수동 주입을 위해, 매체에 추가할 수 있습니다.
- 부화 두 시간 후, 혈청이 중간에 추가됩니다.
IV. 발광 생물 분석에 의해 유전자 발현 분석
- 조각은 luciferin 기판 (3 MG / ML) 100 μl와 함께 주입하고 있습니다.
- 6 - 잘 문화 요리는 무대에서 배치 10 분 incubated입니다.
- 조각은 높은 감도 (그림 1)에서 5 분 몇 군데 있습니다.
V. 대표 결과
그림 1. IVIS 탐지 시스템을 사용하여 환자의 간 슬라이스의 발광 생물 이미징.
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Discussion
우리는 전직 생체내 환자의 조직 문화 방식이 아닌 고정 인체 조직 내에서 유전자 전달의 평가에 대한 발광 생물 탐지 시스템을 설명합니다. 방법은 culturing 조직 슬라이스의 간단하고 재현성 방법을 제공합니다. 그것이 악성 조직을 포함하는 인간 조직의 다양한으로 그대로 인간의 조직에 유전자 전달 연구, 유전자 전달의 분석을 허용하고 존중 개별 환자 간의 다양성의 높은 수준의 효과에 관한 중요한 정보를 제공할 수있는 그것은 중요한 잠재력을 가지고 유전자 이해합니다. 다른 암 종류가 DNA의 이해 및 그 이후의 전사와 번역에 관련된 세포 성공적으로 transgene 표현의 다른 단계의 효능에 영향을 변화 할 수 있습니다. 이 단계는 예제로 바이러스성 벡터를 사용하여 비디오 애니메이션 설명되어 있습니다. 발광 생물 감지 시스템은 조직의 희생을 필요없이 각각의 조각 내의 유전자 발현의 신속하고 정확한 부량을 보여줍니다. 이러한 본 연구에서는 고용과 같은 복제 무능한 벡터의 경우, 발광은 세포의 유전자 발현에 직접 관련되어 있습니다.
이 모델은 시스템은 이전에 입력 임상 실험에 환자 조직 유전자 전달에 관한 귀중한 정보를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 코르크 사우스 의무실 빅토리아 대학 병원 유방 펀드, 아일랜드 암 협회 (CRI07TAN)와 코르크의 암 연구 센터를 통해 투자되었다. CMV 프로 모터의 transcriptional 통제 복제 무능한 재조합 아데노 바이러스 5 입자 교수 앤드류 베이커 글래스고 대학에서 일종의 선물했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
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