Summary
Este artigo descreve a cultura de fatias de tecido de pacientes para estudos de genes de entrega e análise de expressão gênica utilizando IVIS imagem de bioluminescência.
Abstract
Este vídeo descreve o uso de tecido do paciente como um modelo ex vivo para o estudo da entrega do gene. Tecido do paciente fresca obtida no momento da cirurgia é cortado e mantidas em cultura. O sistema modelo ex vivo permite a entrega física de genes em tecidos de pacientes intactos e expressão do gene é analisado por imagem de bioluminescência usando o sistema de detecção de IVIS. O sistema de detecção bioluminescentes demonstra quantificação rápida e precisa da expressão do gene dentro fatias individuais sem a necessidade de sacrificar tecido. Esta fatia do sistema de cultura de tecidos pode ser utilizado em uma variedade de tipos de tecidos, incluindo o tecido normal e maligno e nos permite estudar os efeitos da heterogeneidade do tecido intacto e do alto grau de variabilidade entre pacientes individuais. Este modelo de sistema poderia ser usado em determinadas situações como uma alternativa aos modelos animais e como um modo de pré-clínicos complementares antes de entrar em teste clínico.
Protocol
Preparação de Mídia e Reagentes
- Solução de antibióticos
Tampão fosfato salino (PBS) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone - Média de coleta e tratamento
Dulbecco modificado da águia (DMEM) com 200 U / ml de penicilina, estreptomicina 200 mg / ml, 5 mg / ml Fungizone - Meio de cultura
Médio coleção contendo 10% inativado pelo calor soro fetal bovino
I. coleção de tecidos e de armazenamento
Aprovação para a coleta do tecido do paciente foi obtida a partir da Clínica de Ética em Pesquisa dos Hospitais de Ensino Cork e consentimento informado foi obtido dos pacientes na véspera da cirurgia. Tecido hepático foi obtido de pacientes submetidos a hepatectomia parcial de doença maligna.
- Tecido fresco paciente é obtido no momento da ressecção cirúrgica.
- Tecido é armazenado nos meios de comunicação coleta a 4 ° C (tecido podem ser armazenadas sob refrigeração por até 12 h sem perda significativa de viabilidade, no entanto processamento imediato é recomendado).
II. Preparação do tecido fatia e cultura
Corte foi realizado utilizando um vibratome (Leica, Alemanha). O sistema de corte de tecido foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Preparação fatia de tecido foi realizada sob um capuz estéreis, utilizando instrumentos limpos com 70% 2-propanol. Espessura de corte é de 2.000 microns e cortados com uma lâmina alternativo em 22-26 rpm.
- Tecido é lavado em solução antibiótica três vezes.
- Tecido está ligado à fase de montagem usando non-toxic adesiva (Dermabond).
- Espessura de corte é definida e corte é realizado a 22-26 rpm.
- Fatias são mantidas em meio de cultura em placas de 6 poços de cultura (uma fatia por poço) a 37 ° C com 5% de CO 2 em um ambiente umidificado.
III. A entrega do gene em fatias de tecido
- Fatias são pré-incubadas a 37 ° C por 2 h antes do tratamento.
- Meio de cultura é substituído por meio de tratamento.
- Fatias são diretamente injetados com o vetor (25 mL de partículas virais Ad5.CMVluc [1x10 9]). Viral Alternativamente, as partículas podem ser adicionadas ao meio, para perfusão passiva.
- Após duas horas de incubação, o soro é adicionado ao meio.
IV. Análise de expressão gênica por análise bioluminescentes
- Fatias são injetados com 100 ul de substrato luciferina (3 mg / ml).
- 6-bem placa de cultura é colocada no palco e incubados por 10 min.
- Fatias são gravadas por 5 min a alta sensibilidade (Figura 1).
Representante Resultados V.
Figura 1. Bioluminescent imagem de fatias de fígado de pacientes, utilizando IVIS sistema de detecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós descrevemos um paciente vivo ex método de cultura de tecidos e sistema de detecção de bioluminescentes para a avaliação de entrega de genes no interior não fixa o tecido humano. O método oferece uma maneira simples e reprodutível de fatias de tecido de cultura. Ele tem um potencial significativo, pois permite o estudo da entrega do gene no tecido humano intacto, a análise da prestação de gene em uma variedade de tecidos humanos, incluindo tecido maligno e pode fornecer informações importantes sobre os efeitos do elevado grau de variabilidade entre pacientes individuais com respeito para captação de gene. Tipos diferentes de câncer podem ter variadas influências sobre a eficácia das diferentes fases de expressão do transgene em células de sucesso, envolvendo captação de DNA e posterior transcrição e tradução. Essas etapas são descritas na animação de vídeo, usando vetor viral como um exemplo. O sistema de detecção bioluminescentes demonstra quantificação rápida e precisa da expressão do gene dentro fatias individuais sem a necessidade de sacrificar tecido. Para vetores de replicação incompetente, como empregado neste estudo, a luminescência está diretamente relacionada à expressão de genes por células.
Este modelo de sistema irá fornecer informações valiosas sobre a entrega do gene ao tecido do paciente antes de entrar em teste clínico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado através da Enfermaria Cork South Victoria University Hospital fundo do peito, a Sociedade do Câncer irlandês (CRI07TAN) e do Centro de Cork Cancer Research. Replicação incompetentes recombinante Adenovírus 5 partículas sob o controle transcricional do promotor CMV foi um presente amável do Prof Andrew Baker, da Universidade de Glasgow.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
Dermabond | Johnson & Johnson | ||
Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).