Summary
Questo articolo descrive la cultura di fette di tessuto dei pazienti per studi di consegna dei geni e successiva analisi di espressione genica utilizzando l'imaging bioluminescenza IVIS.
Abstract
Questo video descrive l'uso del tessuto paziente come un modello ex vivo per lo studio della consegna del gene. Tessuto paziente fresche ottenute al momento della chirurgia è affettata e mantenute in coltura. L'ex sistema modello in vivo consente la consegna fisica dei geni nel tessuto del paziente intatta e l'espressione genica viene analizzato per immagini bioluminescenza utilizzando il sistema di rilevazione IVIS. Il sistema di rilevamento bioluminescenti dimostra quantificazione rapida e accurata di espressione genica in singole sezioni, senza la necessità del sacrificio dei tessuti. Questo tessuto del sistema fetta cultura può essere utilizzato in una varietà di tipi di tessuto tra tessuto normale e maligna e ci permette di studiare gli effetti della natura eterogenea del tessuto intatto e l'alto grado di variabilità tra singoli pazienti. Questo modello di sistema potrebbe essere usato in certe situazioni, come alternativa ai modelli animali e come modalità complementare preclinici prima di entrare in sperimentazione clinica.
Protocol
Preparazione dei Media e reagenti
- Soluzione di antibiotici
Tampone fosfato (PBS) con 200 U / ml di penicillina, 200 mg / ml di streptomicina, 5 mg / ml Fungizone - Raccolta e trattamento di medie
Dulbecco modificato (DMEM) con 200 U / ml di penicillina, 200 mg / ml di streptomicina, 5 mg / ml Fungizone - Terreno di coltura
Medio di raccolta contenente 10% di siero siero fetale bovino
I. collezione di tessuti e di stoccaggio
Approvazione per la raccolta dei tessuti dei pazienti è stata ottenuta dalla ricerca clinica Comitato Etico degli Ospedali insegnamento di Cork e il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti il giorno prima dell'intervento. Tessuto epatico è stato ottenuto da pazienti sottoposti a epatectomia parziale per malattia maligna.
- Tessuto paziente fresca si ottiene al momento della resezione chirurgica.
- Tessuti vengono memorizzati in supporti di raccolta a 4 ° C (Tissue possono essere conservati in frigorifero per un massimo di 12 ore senza una significativa perdita di vitalità, tuttavia il trattamento immediato è consigliato).
II. Tessuto preparazione fetta e la cultura
Affettare è stata effettuata utilizzando un vibratome (Leica, Germany). Il sistema di taglio del tessuto è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Fetta di preparazione dei tessuti è stata effettuata sotto una cappa sterile utilizzando strumenti puliti con 70% di 2-propanolo. Spessore della fetta si trova a 2.000 micron e tagliati con una lama alternativo a 22-26 giri al minuto.
- Il tessuto viene lavato in una soluzione antibiotica per tre volte.
- Tessuto è attaccato alla fase di montaggio usando non tossico adesivo (Dermabond).
- Spessore della fetta viene impostato e taglio viene raggiunta a 22-26 giri al minuto.
- Fette sono mantenute nel terreno di cultura in 6 piatti ben cultura (una fetta per pozzetto) a 37 ° C con 5% di CO 2 in un ambiente umidificato.
III. Gene consegna a fette di tessuto
- Fette sono pre-incubazione a 37 ° C per 2 ore prima del trattamento.
- Terreno di coltura viene sostituito con terreno di trattamento.
- Fette sono direttamente iniettati con vettore virale (25 ml di particelle virali Ad5.CMVluc [1x10 9]). In alternativa, le particelle possono essere aggiunti al mezzo, per infusione passiva.
- Dopo due ore di incubazione, il siero viene aggiunto alla media.
IV. Analisi dell'espressione genica mediante l'analisi bioluminescenti
- Fette vengono iniettati con 100 ml di substrato luciferina (3 mg / ml).
- 6-ben piatto cultura è posto sul palco e incubate per 10 min.
- Fette vengono esposte per 5 minuti ad alta sensibilità (Figura 1).
V. Rappresentante Risultati
Figura 1. Bioluminescent immagini di fette di fegato dei pazienti con sistema di rilevazione IVIS.
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Discussion
Descriviamo un ex paziente vivo metodo di coltura e sistema di rilevazione bioluminescenti per la valutazione di consegna del gene non fisse all'interno dei tessuti umani. Il metodo offre un modo semplice e riproducibile di fette di tessuto coltura. Ha un potenziale significativo in quanto consente lo studio della consegna gene in intact tessuti umani, l'analisi di consegna del gene in una varietà di tessuti umani, compreso il tessuto maligno e in grado di fornire importanti informazioni sugli effetti l'elevato grado di variabilità tra i singoli pazienti rispetto per l'assorbimento del gene. Diversi tipi di cancro possono avere diverse influenze sull'efficacia delle diverse fasi di espressione del transgene nelle cellule di successo, coinvolgendo l'assorbimento del DNA e successiva trascrizione e traduzione. Questi passaggi vengono descritti in dell'animazione video, utilizzando vettori virali come esempio. Il sistema di rilevamento bioluminescenti dimostra quantificazione rapida e accurata di espressione genica in singole sezioni, senza la necessità del sacrificio dei tessuti. Per i vettori replica incapace, come impiegato in questo studio, luminescenza è direttamente correlata alla espressione genica di cellule.
Questo modello di sistema fornirà preziose informazioni riguardo la consegna del gene nel tessuto del paziente prima di entrare in sperimentazione clinica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato attraverso il Cork Sud Infermeria fondo Victoria University Hospital con il seno, il Cancer Society irlandese (CRI07TAN) e il Cancer Centre Cork Research. Replica incompetenti ricombinante adenovirus 5 particelle sotto il controllo trascrizionale del promotore di CMV è stata un dono gentile del Prof. Andrew Baker, Università di Glasgow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
